芽孢杆菌BCS 13002的鉴定及同步糖化发酵生产高光学纯度L-乳酸*

刘冬梅 周全兴 周劲松

(华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510640)

乳酸，学名为α-羟基丙酸，分子式为CH3CH(OH)COOH，相对分子质量为90.08.由于分子中含有一个不对称碳原子，故具有旋光性.乳酸是一种用途广泛的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生物都能广泛地应用于医药、化工等诸多领域.但是，由于人体只能代谢L-乳酸，而缺少代谢D-乳酸的相关酶类，所以食品中不适合加入D-乳酸.考虑到其广泛的用途，比如，在食品工业中，可用作酸味剂、保鲜剂和抑菌剂；在医疗行业，具有极好的生物降解性和生物相容性的聚乳酸可用于手术缝合线、药物载体等生物医药材料上[1]；在化工行业，乳酸及其钠盐可作为护肤品的保湿剂、滋润剂[2]，如果能找到适合的生产方式，降低乳酸、特别是高光学纯度L-乳酸的生产成本，就能扩大乳酸的应用范围.

当前，乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶法、生物发酵3种.微生物发酵法是以各种糖类、淀粉类物质为原料接种微生物，发酵生产得到乳酸，由于工艺相对简单、成本低廉、有毒副产物较少，是当前生产乳酸的主要方法.从目前的文献报道看，使用的菌株主要分为根霉、细菌两大类，如黑曲霉、乳酸菌等，亦有使用链球菌 (Streptococcus)、明串珠菌 (Leuconostoc)和肠球菌属(Enterococcus)[3]，但是当前使用的菌株均有其显著缺点，如根霉类菌株多属于好氧发酵，对电、汽要求较高，且产物中杂酸较多，糖酸转化率不高.乳酸菌作为细菌类的代表，是当前乳酸生产的主力，具有发酵周期短，代谢产物单一等优点.但是其发酵温度较低、容易染菌；产物中含有一定量的D-乳酸，导致产物的光学纯度不高；乳酸菌在合成维生素B和一些氨基酸方面存在缺陷，需要在发酵过程中补充复杂的营养成分[4]，这些因素均不利于降低生产成本.

本研究使用的芽孢杆菌BCS 13002具有对营养底物的需求低、本身培养温度高而不易被污染、生产出来的L-乳酸光学纯度高等优点，而且有报道凝结芽孢杆菌能直接利用玉米淀粉发酵，因此具有极大的研究价值与应用潜力.凝结芽孢杆菌本身具有乳酸菌、双歧杆菌的保健功效，已经政府批准用于治疗肠道疾病，证明了该菌株本身及其产物的安全性，又具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性，十分适合转化为工业生产.文中首先比较碳源、中和剂对菌株生长、发酵的影响，经响应面优化了葡萄糖、MgCl2·6H2O和MnSO4·H2O的添加量后，在5 L发酵罐中，分别以葡萄糖和玉米淀粉为碳源，开放式发酵生产L-乳酸，以期找到一个安全、简洁、高效的生产L-乳酸的方式，为后续生产、研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

芽孢杆菌(Bacillussp.)BCS 13002 (CGMCC NO.7431)，由华南理工大学食品质量与安全实验室从发酵泡菜中分离筛选得到，并于2013年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.

1.1.2 材料和试剂

MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、NaOH，分析纯，天津市福晨化学试剂厂出品；3，5-二硝基水杨酸，化学纯，上海科丰化学试剂有限公司出品；98%L-乳酸、93%D-乳酸，色谱纯，上海Sigma-Aldrich公司出品；硫酸，分析纯，广州化学试剂厂出品；丙三醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司出品；耐高温α-淀粉酶(酶活力≥70 000 U/mL)、葡萄糖淀粉酶(酶活力≥130 000 U/mL)，广州裕立宝生物科技有限公司出品；无水葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，广东环凯微生物科技有限公司出品；溶菌酶，生化试剂，北京天恩泽生物公司出品；DNA提取试剂盒、TBE电泳缓冲液、DNA Marker (D-2000)，Takara公司出品；超纯水，实验室自制.

1.1.3 试剂溶液及培养基的配制

(1)种子培养基：无水葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉25 g，溶解于1 L超纯水中，混合均匀后于121 ℃灭菌，20 min后冷却备用；

(2)基础发酵培养基：在种子培养基中多加入36 g的无水葡萄糖，混合均匀后于121 ℃灭菌，20 min后冷却备用；

(3)0.005 mol/L的H2SO4溶液：浓硫酸0.27 mL，用超纯水定容至1 000 mL.

1.2 仪器与设备

JJ200Y电子天平(美国双杰兄弟(集团)有限公司出品)，YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂出品)，5804R低温高速冷冻离心机(艾本德中国有线公司出品)，PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司出品)，752S紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司出品)，XSP-2CA生物显微镜(上海光学仪器厂出品)，Biostat Aplus 5 L自动发酵罐系统(德国布朗公司出品)，高效液相色谱仪系统含600泵多通道输送系统、717自动进样器、2996 PDA 二极管阵列检测器(沃特世科技上海有限公司出品)；色谱柱为手性柱 Chirex 3126 (D)-penicillami，4.6 mm ID×250 mm L，5 μm；有机酸柱Rezex ROA-Organic Acid H+，300 mm7.8 mm(美国菲罗门公司出品).

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的分子生物学和生理生化鉴定

根据参考文献[5]进行菌株的DNA提取，取过夜培养的菌液1.0 mL，于12000 r/min室温离心1 min，弃上清液，沉淀重悬于0.6 mL的溶菌酶溶液中，颠倒混匀5～10次后置于37 ℃保温40 min，利用试剂盒提取菌种基因组DNA；利用其模板DNA进行PCR扩增，扩增体系如表1所示，PCR扩增条件为：94 ℃、预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸5 min.电泳检测回收并将扩增得到的片段进行DNA测序，通过与NCBI数据库中的序列BLAST比对，进行16S rDNA鉴定.分离株的形态生理生化检测分析可参照伯杰氏细菌鉴定手册(第9版)[6]进行.

1.3.2 HPLC测定发酵液中L-乳酸及葡萄糖含量

①L-乳酸的测定：发酵液样品经8 000 r/min离心，取上清液适当稀释后，过0.22 μm滤膜过滤后备用；流动相为2 mmol/L CuSO4溶液(溶剂为5%的异丙醇溶液)，使用前经0.22 μm滤膜过滤，超声脱气；流速为1.2 mL/min；柱温为40 ℃；检测器为二极管阵列，检测波长为254 nm；标准品和样品溶液用前均经过0.22 μm滤膜过滤并超声脱气；进样量为5 μL；用Empower积分软件积分.②葡萄糖含量测定：样品处理与①相同，流动相为0.005 mol/L的H2SO4溶液，流速为0.6 mL/min；柱温为40 ℃；示差检测器检测；进样量为10 μL.

1.3.3 淀粉酶活力测定

参照GBT 24401—2009 α-淀粉酶制剂进行.

1.3.4 碳源对BCS 13002发酵生产L-乳酸的影响

以发酵基础培养液为基础，设定总碳源含量为20 g/L，把葡萄糖和木糖按5∶0、3.75∶1.25、2.5∶2.5、1.25∶3.75、0∶5 的比例组合，添加到培养基中，另把葡萄糖和玉米淀粉按5∶0、2.5∶2.5、0∶5的比例组合，添加到另一组培养基中，以8 mol/L的NaOH为中和剂，调节培养基初始pH值至6.5左右，在45 ℃、120 r/min下震荡培养48 h，取样测定L-乳酸和乙酸的含量，比较碳源对L-乳酸生产的影响.

1.3.5 中和剂对BCS 13002发酵生产L-乳酸的影响

以基础发酵培养基按1.3.4的方式震荡培养，中和剂分别使用Ca(OH)2粉末、CaCO3粉末和8 mol/L的NaOH，每隔6～8 h调节培养基的pH值，使之保持在6.5附近，48 h后取样测定L-乳酸和乙酸的含量，比较不同中和剂对L-乳酸生产的影响.其中，针对CaCO3粉末会与乳酸生成乳酸钙沉淀，需特别加入4 mol/L H2SO4溶液调pH值至2附近，记录使用的H2SO4溶液的体积，用以折算L-乳酸和乙酸的含量.

1.3.6 BCS 13002在5 L发酵罐中的分批补料发酵生产L-乳酸

根据前期的研究，把充分活化的菌种活化液按5%的体积比接入装有1 L基础发酵培养基的5 L全自动发酵罐中，培养条件为45 ℃、120 r/min，以 8 mol/L的NaOH为中和剂，控制pH在6.5.发酵期间，每6～8 h取样，按照1.3.2测定发酵液中葡萄糖含量及L-乳酸含量，当葡萄糖含量小于10 g/L时，补充46 g无水葡萄糖粉末，共补充5次，至葡萄糖不再消耗即为发酵终点.

1.3.7 以玉米淀粉为原料分批补料发酵生产L-乳酸

配制20%玉米淀粉溶液，加入10 μL耐高温α-淀粉酶(酶活力≥70 000 U/mL)，70 ℃搅拌水浴20 min，制成玉米淀粉水解液，然后与32 μL耐高温葡萄糖淀粉酶(酶活力≥130 000 U/mL)、5%芽孢杆菌BCS13002种子活化液一同接入装有2 L基础发酵培养基的5 L全自动发酵罐中进行同步糖化发酵，期间以8 mol/L NaOH作为中和剂，培养条件如1.3.6.发酵期间，每隔6～12 h取样测定葡萄糖含量和L-乳酸含量，当葡萄糖不再产生且L-乳酸含量不再增加时，补充250 g的20%玉米淀粉水解液，共补充6次，至葡萄糖不再消耗即为发酵终点.

1.3.8 糖酸转化率的计算

发酵结束后，分别按照实验方法(2)和(3)测定L-乳酸含量和葡萄糖含量，并根据发酵终点发酵液的体积计算L-乳酸和葡萄糖质量，再根据以下公式计算糖酸转化率，糖酸转化率即为：生产L-乳酸质量/(葡萄糖总质量-残余葡萄糖质量)100%.当使用玉米淀粉进行同步糖化发酵时，总的葡萄糖质量按玉米淀粉彻底水解所产生的葡萄糖的量计算，理论上每100 g的玉米淀粉水解后可得到110 g的葡萄糖，文中实际测得为105 g.

2 结果与讨论

2.1 BCS 13002的鉴定

BCS13002在平板上的单菌落呈圆形凸起且富有光泽，边缘整齐无皱褶，表面光滑，菌落呈乳白色，稍透明.菌种经结晶紫单染后，再经过16×100倍放大，在光学显微镜下观察，菌体为杆状.生理特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐，精氨酸水解阴性，酪素水解阴性，V-P试验阳性，革兰氏染色为阳性菌，兼性厌氧菌，可利用阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用鼠李糖、棉籽糖.产酸不产生气，能水解淀粉，在15～60 ℃的温度下生长.提取其DNA，扩增其16S rDNA并测序，其与Bacilluscoagulans(凝结芽胞杆菌)的16S rDNA 序列有大于99%的同源性，见图1核苷酸序列，并构建进化树见图2.根据形态、生理生化特性和DNA保守序列等3方面的信息，确定其为凝结芽孢杆菌.

图1 BCS 13002菌株的16S rDNA序列

图2 BCS 13002的进化树

2.2 培养基中3种碳源对BCS 13002发酵生产L-乳酸的影响

如图3所示，使用葡萄糖作为唯一碳源时，产物以L-乳酸为主，发酵48 h后，L-乳酸为16.05 g/L，乙酸为4.71 g/L，L-乳酸与乙酸的比例约为3.41，随着碳源的补充，L-乳酸继续积累，L-乳酸的比例持续增大.当碳源中葡萄糖的比例降低(按质量比计)，木糖比例升高时，L-乳酸的比例持续下降.以木糖作为唯一碳源时，生产的L-乳酸为11.51 g/L，乙酸为 9.82 g/L，L-乳酸与乙酸的比例为1.17，随着碳源的补充，乙酸将持续大量的积累而L-乳酸基本不再产生.说明BCS 13002适合以葡萄糖为碳源生产L-乳酸.

图3 葡萄糖与木糖的不同质量比对产酸的影响

Qin等[7]使用的菌株以葡萄糖为碳源，Ye等[8]使用的菌株以木糖为碳源，Kenneth等[9]使用的菌株是以葡萄糖、木糖、树胶醛糖为复配碳源，他们的乳酸产率均超过85%，均属于同型发酵.一般认为葡萄糖通过EMP途径进行同型发酵，木糖通过磷酸戊糖途径(PP)进行同型发酵[10]，但对于混合糖源的代谢通路，仍有待研究.而本研究中的BCS 13002利用葡萄糖作碳源生产L-乳酸时，糖酸转化率约为82.31%，说明葡萄糖应是通过EMP途径进行代谢[11].

同时，本研究还比较了玉米淀粉和葡萄糖作碳源时，菌株的产酸效果，为下一步同步糖化提供参考.如图4所示，碳源以葡萄糖为主时，产物仍以L-乳酸为主.逐渐提高碳源中玉米淀粉的比例(按质量比计)，会导致产物中L-乳酸大量减少，乙酸大量增多，碳源完全由玉米淀粉构成时，发酵产物中基本不含有L-乳酸，乙酸含量高达14.05 g/L.另外，研究中还发现，玉米淀粉能促使BCS 13002分泌胞外淀粉酶，其酶活最高达3 873 U/mL，当碳源完全由葡萄糖组成时，无法测出淀粉酶酶活，说明玉米淀粉是刺激菌株分泌胞外淀粉酶的主要诱因.

图4 葡萄糖与淀粉的不同质量比对产酸的影响

目前，有关凝结芽孢杆菌生产乳酸的报道，主要有3种方式，一是直接使用戊糖、己糖作为碳源；二是使用木质素、各类淀粉，以液化酶、糖化酶处理，或者经酸碱、高温、高压处理后，作为碳源加入；三是多种细菌协同作用，分解大分子多糖原料[11].Ohkouchi等[12]利用乳酸杆菌发酵淀粉和食物残渣生产L-乳酸，并研究了pH和锰离子对乳酸产量的影响，发现当Mn2+的含量从0分别提高到20、200 μmol/L时，乳酸的产率从0.082 g/(L·h)分别提高到0.187和0.206 g/(L·h).Narita等[13]用牛链球菌转化粗淀粉为L-乳酸，转化率为88%，乳酸光学纯度为95.6%，这些都可以为后续研究所借鉴.

2.3 3种中和剂对BCS 13002发酵生产L-乳酸的影响规律

图5所示，使用NaOH作为中和剂调节发酵液pH值时，乳酸产量明显高于另外两种中和剂，最终产量可达67 g/L.使用Ca(OH)2作为中和剂，L-乳酸产量为56 g/L，而使用CaCO3时，得到L-乳酸最少，为43 g/L.Qin等[14]分析了Na+与Ca2+对菌株代谢的影响，发现Na+与Ca2+分别使菌株1213和712个基因的表达量产生明显变化.Ca2+使糖酵解通路几个关键酶的表达出现显著上调，而Na+使L-乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶和6-磷酸果糖激酶的表达下调的同时使丙酮酸脱氢酶复合体的表达量显著上调.而BCS 13002显然对Na+有更高的适应性，Na+有助于L-乳酸的积累.

图5 使用3种中和剂的发酵液中乳酸含量的变化

Fig.5 Changes of lactic acid in culture by three neutralizing agents

2.4 BCS 13002在5 L发酵罐中的分批补料发酵生产L-乳酸的规律

经响应面优化分析，得到最优的基础发酵培养基配方，在此基础上进行分批补料发酵生产L-乳酸，结果如图6所示.随着葡萄糖的积累，菌株生产L-乳酸的速度明显下降，从2.02 g/(L·h)下降至0.27 g/(L·h)，在54～78 h间基本停止生产L-乳酸，证明葡萄糖的积累会对菌株生产L-乳酸产生负面的影响.为验证Mg2+与Mn2+离子的作用，在第78 h时分别加入0.07 g的MnSO4·H2O和0.04 g的MgCl2·6H2O.78 h以后，L-乳酸的产率开始回升，于144 h达到第2阶段的最高峰0.89 g/(L·h)，最终的糖酸转化率为82.31%.这说明，Mn2+和Mg2+确实有助于细胞抵抗较高的渗透压，提高了L-乳酸的产率.同时由于发酵过程中不停地补充空气，所以，可认为Mn2+还有助于抵抗细胞中的过氧化物的伤害，维护电子传递链及代谢通路的畅通，Archibald[15]和马瑞等[16]的研究也得到了类似的结论.但是，Ohkouchi等[12]认为，Mn2+的加入，有助于有机酸产率的提升却对总产量没有影响，这仍有待更深入地研究.

图6 分批补料发酵L-乳酸和葡萄糖的含量变化

Fig.6 Changes ofL-lactic and glucose in culture by fed-batch method

2.5 以玉米淀粉为原料同步糖化发酵生产L-乳酸的规律

图7 同步糖化发酵时L-乳酸和葡萄糖的含量变化

3 结论

BCS 13002具有耐高温、营养因子要求低等特点，培养基可以不灭菌直接进行发酵，而且，BCS 13002生产的L-乳酸光学纯度高达99.8%以上，无需再用基因工程等手段对菌株进行调整，十分适合工业化生产的要求.本研究通过一系列实验得到BCS 13002的最优培养条件.以NaOH作为中和剂的效果优于使用CaCO3和Ca(OH)2作为中和剂.BCS 13002可分别利用木糖、葡萄糖和玉米淀粉生产有机酸，但以木糖和玉米淀粉作为原料时，产物主要以乙酸为主，以葡萄糖和玉米淀粉水解液为碳源时，主要生产L-乳酸.在5 L发酵罐中，以玉米淀粉为原料，配合适当的预处理手段，以分批补料、同步糖化的发酵方式，可以替代葡萄糖，生产L-乳酸.以葡萄糖为碳源分批补料发酵生产L-乳酸，总产量为115.86 g/L，糖酸转化率约为82.31%，以玉米淀粉为原料同步糖化发酵生产L-乳酸，总产量为123.3 g/L，由于有CO2生成，糖酸转化率约为70.03%.

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