甜菜果胶中性糖的水解方法及定量分析*

于淑娟 王智明 郭晓明李太鸿 艾超 郭筱兵

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院, 广东 广州 510640;2.华南理工大学 广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室, 广东 广州 510640)

果胶是高等植物细胞壁中的结构多糖,其结构复杂.果胶分子由聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-I)、II型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-II)、木糖半乳聚糖 (XGA)等4种特异性的结构多糖组成,并有相应的结构模型[1].HG是由D-半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键连接而成的均一多糖,而其他结构单元则大部分或完全由中性糖组成.中性糖单元种类多、连接方式复杂.据报道,组成果胶的中性糖可能多达12种.中性糖间通过复杂的糖苷键构成了果胶的侧链结构,从而影响果胶的分子构象及物化性质等[2- 3].根据植物来源的不同,中性糖含量介于16.0%～51.1%之间[3- 4],通常由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖等组成.

果胶中性糖的定量分析是解析果胶的结构和功能特性的重要手段.然而,中性糖的彻底释放和准确检测是关键.随着高效阴离子交换色谱(HPAEC)、蒸发光散射(ELSD)和气液相色谱等方法的开发及应用[5- 6],中性糖分离与检测难的问题已经解决.目前,中性糖的准确定量的关键是如何彻底地水解果胶中性糖单元.

无机酸是水解果胶中性糖最常用的预处理方法.该法采用硫酸、盐酸、三氟乙酸(TFA)等水解试剂,在强酸(1～2 mol/L)、高温(100～120 ℃)下进行,水解条件越剧烈,中性糖的释放越彻底,但也引发了中性糖降解的问题[3,7].Garna等[6]建立了一种由三氟乙酸(TFA)复合果胶酶水解的方法(以下简称Garna法),以较为温和的方式获得满意的水解效果.Garna法对苹果果胶、橘皮果胶具有良好的水解效果,但对于其他来源果胶的作用效果尚不明确.

甜菜果胶是一种新型的果胶,围绕其结构与功能性的研究已成为果胶领域关注的焦点之一[8- 9].甜菜果胶结构特殊,其中性糖含量较苹果果胶、橘皮果胶等高[10].此外,研究证实，甜菜果胶的乳化活性与中性糖结构及其完整性具有密切的关系[5].因此,寻找一种针对甜菜果胶中性糖的定量方法具有重要的意义.本研究在Garna法的基础上,采用果胶酶复合无机酸水解甜菜果胶中性糖,并用HPAEC测定甜菜果胶中的单糖组分,以期为甜菜果胶中性糖结构表征提供一种高效、针对性强的检测方法.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

自制甜菜果胶(编号1、2、3),制备方法详见文献[11]; 果糖，纯度≥97%,阿拉伯糖,纯度≥98%,鼠李糖、半乳糖、木糖,纯度≥99%,美国Sigma-Aldrich Chemical 公司产品; 葡萄糖(分析纯),上海博奥生物科技有限公司产品;果胶酶(Rapidase C80),荷兰DSM公司产品; 复合植物水解酶(Viscozyme L),丹麦Novozymes公司产品; Pectinase PL,日本Amano公司产品; 三氟乙酸(分析纯),上海Aladdin生化科技股份有限公司产品; 氢氧化钠，50%(色谱纯),德国Merck公司产品; 其他试剂均为分析纯.

ICS- 5000型阴离子交换色谱系统,配备电化学检测器(ED50),美国Dionex公司生产; Waters 600型高效液相色谱仪,美国Waters公司生产; RO10型磁力搅拌器,德国IKA公司生产; FE20型数显pH计,瑞士Mettler-Toledo公司生产; 玻璃消解管,美国HACH公司生产; HH-2型数显恒温水浴槽,常州澳华仪器有限公司生产;DF- 101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限公司生产.

1.2 实验方法

1.2.1 果胶酶液内源性单糖的测定

选取C80、Viscozyme L(简称为VL)、PL 3种果胶酶制剂,分析自身携带的小分子糖的含量及组成.将酶液用去离子水稀释1 250倍,取5 mL于密封消化管中,100 ℃灭酶5 min,备用.

采用透析法除去果胶酶液中的小分子糖等物质,比较小分子糖含量在透析前后的变化.将酶液用20 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释25倍后,置于20 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中，4 ℃透析30 h(截留相对分子质量为3 000～3 500),每6 h更换透析废液.透析结束后,用同样的缓冲液稀释至100 mL,4 ℃储藏不超过48 h,备用.酶液过0.45 μm滤膜,待HPAEC分析用.

1.2.2 两步法水解甜菜果胶

甜菜果胶的水解程序基于Garna法,但有所改动(见图1).准确称取10.0 mg左右的样品于密封消化管中,加入4 mL 0.2 mol/L TFA,密封后于80 ℃恒温油浴水解72 h.酸解结束后,用氨水调pH值至7,再用蒸馏水稀释定容至25 mL.取上述水解液 4 mL于密封消化管中,等体积加入纯化后的果胶酶液,于50 ℃水解24 h.水解液经灭酶(100 ℃、5 min)、过膜(0.45 μm)后,用HPAEC分析.平行测定3次.

图1 Garna法与本研究分别采用的水解程序

Fig.1 Hydrolyzing procedures of the Garna method and the proposed method in this paper

1.2.3 果胶酶酶解时间的确定

根据1.2.1节研究结果筛选目的果胶酶,在最佳酶解pH(5.0)、温度(50 ℃)条件下,优化其酶解甜菜果胶的最佳时间.配制2 mg/mL的甜菜果胶溶液，取2 mL果胶溶液于密封消化管中,加入2 mL C80果胶酶溶液,置于50 ℃水浴酶解(1～24 h).水解液灭酶，稀释定容至25 mL.过膜,待HPAEC分析用.平行测定3次.

1.2.4 TFA酸解条件的优化

根据1.2.3节最佳酶解条件制备酶解样品.灭酶后,加等体积TFA溶液以调节溶液的酸浓度.考察TFA浓度(1 mol/L和2 mol/L)、酸解温度(100、110、120 ℃)、酸解时间(1～5 h)对水解效果的影响.酸解结束后,水解液用浓氨水调pH值至7,稀释定容至 25 mL,过膜,待HPAEC分析用.平行测定3次.

1.2.5 色谱条件

采用HPAEC法测定甜菜果胶中性糖含量，详见文献[11].

半乳糖醛酸测定条件:高效阴离子分析柱CarboPac PA 200 (4×250 mm,美国戴安公司)和CarboPac PA 200保护柱(4×50 mm,美国戴安公司),由电化学检测器检测样品; 淋洗条件:0～5 min,100 mmol/L NaOH,5～13 min,100 mmol/L NaOH,150 mmol/L CH3COONa,13～20 min,500 mmol/L NaOH; 流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,进样量25 μL.根据峰面积大小,采用外标法(y=1.787 2x-0.216 2,r2=0.999 9)对半乳糖醛酸进行定量.

相对分子质量分布曲线测定:利用体积排阻色谱法测定甜菜果胶及其水解产物的相对分子质量分布曲线[12].

2 结果与讨论

2.1 果胶酶液内源性单糖分析

本研究采用HPAEC法测定3种果胶酶自身携带的小分子糖的含量及组成,以便为果胶酶筛选提供参考,并排除自身携带的小分子糖对分析结果的干扰.结果表明,3种果胶酶自身均含小分子糖,但单糖的种类因酶种类而异(见表1).VL的单糖含量为67.1 mg/mL,所含葡萄糖高达40.1 mg/mL,是3种果胶酶中单糖含量最高的.值得注意的是,VL所含单糖种类繁多,除了半乳糖、萄葡糖、木糖外,还含有果糖(22.7 mg/mL).PL含有4种单糖,含量由高到低依次为:半乳糖>木糖>阿拉伯糖>葡萄糖,4种单糖含量总和达7.00 mg/mL.C80自身携带小分子糖种类最少,由少量的半乳糖、葡萄糖和木糖组成.上述结果表明,果胶酶液中的单糖将干扰检测结果,最终导致总中性糖含量偏高.

对果胶酶液进行透析,以降低果胶酶自身携带小分子糖的含量.结果表明,C80、PL酶液经透析稀释至100倍后,各单糖含量均低于检测限,而VL透析酶液的单糖总量则降低为初始含量的1/8左右.

表1 果胶酶液内源性单糖含量1)

Table 1 Sugar composition of commercial pectinase mg/mL

果胶酶鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖果糖中性糖C80——1.100.200.10—1.40PL—0.805.000.101.10—7.00VL——2.6040.101.7022.7067.10VL-透析——0.303.201.603.108.20

1)单糖含量是指每毫升酶液中的单糖质量(mg)，为两次平行测定的平均值.

2.2 果胶酶种类对Garna法水解效果的影响

本研究采用Garna法水解程序,让甜菜果胶在TFA溶液中(0.2 mol/L)水解为低聚物,再用不同果胶酶进一步水解中性糖单元.为比较单独酸水解、酸复合酶水解的效果,采用体积排阻色谱法(HPSEC)测定不同酶解液的相对分子质量分布曲线.如图2所示,甜菜果胶(见图2中对照组)具有典型的宽分布相对分子质量分布曲线(9～15 min).经TFA酸解72 h后(见图2中0.2 mol/L TFA,72 h),甜菜果胶相对分子质量急剧下降,相对分子质量分布曲线后移、变窄(14～16 min).随后,水解液中的甜菜果胶继续被C80(见图2中0.2 mol/L TFA,72 h+C80)、VL(见图2中0.2 mol/L TFA,72 h+VL)水解.比较C80与VL酶解后的相对分子质量分布曲线发现,C80对甜菜果胶的大分子组分(14～15 min)的水解能力更强.值得注意的是,虽然C80的酶解效果更好,但其无法将甜菜果胶彻底水解为单糖.以上结果表明,不仅TFA的酸解效果有限,且TFA复合酶法后也未能将甜菜果胶彻底水解为单糖.

如表2所示,不同果胶酶对甜菜果胶的辅助水解效果具有显著的影响.3种果胶酶的水解能力从高到低依次为:C80>VL>PL.C80对甜菜果胶的阿拉伯糖、半乳糖单元的辅助水解效果更好,在C80参与下,Garna法水解得到的阿拉伯糖和半乳糖两种单糖的总量,分别为VL、PL的1.1倍、1.2倍.

研究证实,甜菜果胶鼠李糖含量(高达5.0%)高于商品化果胶[12- 13].然而,本研究测得的甜菜果胶鼠李糖含量仅为1.2%～1.9%,与报道的数据不符,这说明Garna等[6]报道的水解程序不足以彻底水解甜菜果胶的鼠李糖.尽管Garna等[6]的研究结果表明VL能水解橘皮果胶、苹果渣果胶的中性糖.但对于甜菜果胶而言,由鼠李糖组成的RGI结构区域更多,这可能不利于酶解的进行.据报道,VL是由阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等组成的复合酶[14].可能是VL含有木聚糖酶活性较高的缘故,其水解液中的木糖含量最高(1.1%).与VL相比,C80对木糖的酶切活性次之,PL的木糖活性则最低.

图2 酸法及酶-酸复合水解对甜菜果胶相对分子质量分布的影响

Fig.2 Effects of acid and enzyme-acid hydrolyses on relative molecular weight distribution

表2 果胶酶对甜菜果胶中性糖水解效果的影响

Table 2 Effects of commercial pectinase on enzymatic hydrolysis of neutral sugars of sugar beet pectin %

果胶酶鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖中性糖C801.5±0.027.2±0.018.3±0.013.1±0.120.9±0.1021.0±0.22VL1.9±0.346.6±0.487.3±0.362.6±0.021.1±0.0319.6±0.55PL1.2±0.026.4±0.026.2±0.003.5±0.130.6±0.1418.0±0.25

由于C80的酶解效果好且杂糖少(见表1),故本研究以C80作为目的果胶酶,并进一步优化C80的酶解时间.

2.3 C80酶解条件

如图3所示,随着酶解时间的延长,阿拉伯糖、半乳糖逐渐从果胶分子上释放出来,酶解15 h后两者含量分别达到3.5%、4.1%.C80对鼠李糖、葡萄糖、木糖等的水解能力十分有限,这3种单糖的含量始终低于1.0%.由此确定C80酶解时间为15 h.

果胶酶C80对鼠李糖、葡萄糖、木糖的酶解长达20 h时,这3种单糖的含量仍未见明显升高.因此,单独采用果胶酶C80无法彻底水解甜菜果胶,需联合其他方法才能获得更高的水解率.

2.4 TFA酸解条件

多种无机酸可用于水解果胶多糖[9].但由于在1 mol/L TFA、100 ℃的条件下(见图4(a)),各糖苷键逐渐被水解.酸解2 h后,阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖基本达到峰值,相应含量分别为8.4%、10.4%、1.0%.随后,进一步延长酸解时间至5 h,上述3种单糖并未发生降解,这与Garna等[6]的研究结果一致.值得注意的是,葡萄糖含量始终处于较低水平,不依赖于酸浓度、酸解温度等,这可能是葡萄糖单元已被C80水解完全.

图3 pH 5、50 ℃时C80酶解甜菜果胶结果

Fig.3 Enzymatic hydrolysis results of sugar beet pectin by C80 at pH 5 and 50 ℃

维持酸解温度100 ℃不变,将TFA浓度增大为2 mol/L(见图4(b)),部分单糖含量的变化趋势不变.然而,鼠李糖含量在2～5 h内逐渐升高至3.0%,而阿拉伯糖含量则在2～5 h内逐渐从8.9%下降至7.3%.Thibault等[15]发现Rha-GalA的糖苷键稳定性较高,其耐酸性强于其他糖苷键.据此,在相同酶解温度下(100 ℃),1 mol/L TFA不足以完全破坏鼠李糖与半乳糖醛酸间的糖苷键; 2 mol/L TFA水解鼠李糖的能力更强,但也导致阿拉伯糖降解.

当TFA浓度为1 mol/L时,将酸解温度由100 ℃提高至110 ℃后,中性糖的水解速度显著升高(见图4(c)).在此条件下,阿拉伯糖、半乳糖、木糖等在水解1 h后迅速达到峰值.鼠李糖含量随酸解时间的延长而逐渐升高,在4 h时达到峰值(3.4%),此时的鼠李糖含量约为100 ℃下最高值的3.4倍.随着酸解时间进一步延长至5 h,阿拉伯糖、鼠李糖含量开始缓慢下降,这表明阿拉伯糖、鼠李糖发生降解.当酸解条件为110 ℃、2 mol/L TFA时(见图4(d)),阿拉伯糖和木糖在水解1 h后达到峰值.随后,由于高温和强酸的双重作用,阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等均出现不同程度的降解.

图4 TFA酸解甜菜果胶结果 Fig.4 Acid hydrolysis results of sugar beet pectin by TFA

如图4(e)所示,在1 mol/L TFA、120 ℃的酸解条件下,经酸解1 h后,阿拉伯糖、木糖的含量均迅速上升至峰值.然而,当酸解时间超过3 h后,阿拉伯糖、半乳糖的含量开始下降,但木糖的含量却保持稳定.有异于其他中性单糖,鼠李糖含量在前3 h内逐渐升高至峰值(3.2%),随后出现轻微的下降.当TFA浓度升高至2 mol/L(见图4(f))后,阿拉伯糖、半乳糖提前发生降解(2 h).此外,鼠李糖含量达到峰值所需的酸解时间也缩短为2 h.

以上研究结果(见图4)表明,不同中性糖单元间的糖苷键具有不同的耐酸性,且不同游离中性糖在强酸溶液中的稳定性也存在显著差异.束缚鼠李糖的糖苷键很稳定,只有高温、强酸才能将其彻底水解,但剧烈的酸解条件也引发阿拉伯糖与半乳糖的降解.因此,酸解程序的确定需要权衡鼠李糖的水解率与阿拉伯糖、半乳糖的保留率间的关系.

对于甜菜果胶而言,富含鼠李糖是它的重要结构特征.鼠李糖的准确定量对于揭示甜菜果胶的结构特征及功能关系具有重要的意义.因此,在确定酸解程序时,优先考虑鼠李糖的水解率.综合考虑上述因素,最终确定酸解条件为：TFA浓度1 mol/L,温度110 ℃,酸解时间4 h.

测定了各标准单糖在最适水解条件(1 mol/L TFA,110 ℃和4 h)下的降解率,以便从侧面反映甜菜果胶中性糖在该条件下的降解程度.结果表明,游离鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的降解率分别为11.4%、12.0%、9.7%、8.9%以及18.6%.对于实际果胶样品而言,只有当中性糖转变为游离单糖后,这些单糖才能进而被降解.因此,在相同水解条件下,样品中性糖的实际降解率应更低.在最适水解条件下,糖苷键的水解与单糖的降解并存.尽管甜菜果胶的中性单糖也发生一定程度的降解,但各组成单糖的水解率仍较为理想.

2.5 果胶酶-酸法复合水解对甜菜果胶大分子结构的影响

为验证C80复合酸法的水解效果,采用HPSEC技术分析了甜菜果胶的相对分子质量分布曲线.如图5所示,经C80复合酸法处理后,甜菜果胶的相对分子质量分布曲线发生显著的变化.酶解前,甜菜果胶的相对分子质量分布曲线(见图5中对照组)为典型的宽分布曲线(峰1,9～15 min).经C80酶解后(见图5中C80酶解),大分子物质逐渐转化为小分子组分(峰2).此外,在TFA的进一步水解作用下(见图5中C80酶解-酸解),大分子物质彻底水解成聚合度大于2的多糖组分(峰3).

为了进一步明确峰3是否为半乳糖醛酸聚合物,采用HPAEC分析了水解液中的游离半乳糖醛酸含量,测得水解液中游离的半乳糖醛酸含量为37.9%.然而,由3-苯基酚显色法[16]测定的总半乳糖醛酸含量却为61%.以上结果表明,水解液中含有23.1%的半乳糖醛酸以聚合的形式存在,从而间接证明峰3(见图5)为半乳糖醛酸低聚物.

图5 甜菜果胶在酶-酸复合水解过程中的相对分子质量分布曲线

Fig.5 Relative molecular weight distribution profiles of sugar beet pectins during the enzyme-acid hydrolysis

2.6 方法的稳定性评价

根据2.3、2.4节研究结果确定两步法水解工艺,并对该法的稳定性、重复性进行验证.如表3所示为平行测定5次的结果,虽然受试3个甜菜果胶样品的中性糖含量各异,但同一样品的中性单糖含量具有良好的平行性.这说明两步水解法具有可重复性,能满足样品检测的要求.

表3 C80-酸法对甜菜果胶的水解效果

Table 3 Hydrolyzing effect of C80-acid method toward sugar beet pectins %

甜菜果胶鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖中性糖13.7±0.116.1±0.218.9±0.300.8±0.072.5±0.1622.0±0.2825.1±0.224.7±0.239.3±0.190.4±0.030.8±0.0320.3±0.5033.8±0.222.6±0.099.9±0.370.5±0.030.6±0.0617.5±0.05

3 结论

本文建立了一种定量分析甜菜果胶中性糖的方法,该方法涉及样品前处理、高效阴离子交换色谱检测等两部分.样品预处理程序依次通过C80酶解(pH 5、50 ℃、15 h)、TFA酸解完成; 单糖通过Carbopac PA1分析柱、电化学检测器分别进行分离、检测.TFA酸解温度为110 ℃时,有利于鼠李糖的充分水解,但阿拉伯糖、半乳糖容易发生降解.综合考虑中性糖的水解率及降解率,最终确定TFA酸解条件为:TFA浓度1 mol/L,温度110 ℃,酸解时间4 h.两步水解法具有良好的水解稳定性、重复性,结合HPAEC检测可实现甜菜果胶中性糖的准确定量.

[1] MOHNEN D.Pectin structure and biosynthesis [J].Current Opinion in Plant Biology,2008,11(3):266- 277.

[2] BRACCINI I,GRASSO R P,PÉREZ S.Conformational and configurational features of acidic polysaccharides and their interactions with calcium ions:a molecular modeling investigation [J].Carbohydrate Research,1999,317(1):119- 130.

[3] BIERMANN C J.Hydrolysis and other cleavages of glycosidic linkages in polysaccharides [J].Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,1988,46(1):251- 271.

[4] MCFEETERS R.Changes in pectin and cellulose during processing [J].Chemical Changes in Food During Processing,1985,38(3):347- 372.

[5] 王艳颖,胡文忠,庞坤,等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定苹果中可溶性糖的含量 [J].食品与发酵工业,2008,34(6):129- 131.

WANG Yan-ying,HU Wen-zhong,PANG Kun,et al.Determination of the soluble sugars in apple by high perfor-mance liquid chromatograghy with evaporative light sacttering detcctor (HPLC-ELSD) [J].Food and Fermentation Industries,2008,34(6):129- 131.

[6] GARNA H,MABON N,WATHELET B,et al.New me-thod for a two- step hydrolysis and chromatographic analysis of pectin neutral sugar chains [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(15):4652- 4659.

[7] De RUITER G A,SCHOLS H A,VORAGEN A G,et al.Carbohydrate analysis of water-soluble uronic acid-containing polysaccharides with high-performance anion-exchange chromatography using methanolysis combined with TFA hydrolysis is superior to four other methods [J].Ana-lytical Biochemistry,1992,207(1):176- 185.

[8] FISHMAN M L,CHAU H K,QI P X,et al.Physico-che-mical characterization of protein-associated polysaccharides extracted from sugar beet pulp [J].Carbohydrate Polymers,2013,92(2):2257- 2266.

[9] WILLIAMS P A,SAYERS C,VIEBKE C,et al.Elucidation of the emulsification properties of sugar beet pectin [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(9):3592- 3597.

[10] SAKAMOTO T,SAKAI T.Analysis of structure of sugar-beet pectin by enzymatic methods [J].Phytochemistry,1995,39(4):821- 823.

[11] GUO X,MENG H,ZHU S,et al.Stepwise ethanolic precipitation of sugar beet pectins from the acidic extract [J].Carbohydrate Polymers,2016,136(2):316- 321.

[12] YAPO B,ROBERT C,ETIENNE I,et al.Effect of extraction conditions on the yield,purity and surface pro-perties of sugar beet pulp pectin extracts [J].Food Chemistry,2007,100(4):1356- 1364.

[13] LEVIGNE S,RALET M-C,THIBAULT J-F.Characterisation of pectins extracted from fresh sugar beet under different conditions using an experimental design [J].Carbohydrate Polymers,2002,49(2):145- 153.

[14] SØRENSEN H,R MEYER A,S PEDERSEN S.Enzyma-tic hydrolysis of water-soluble wheat arabinoxylan.1.synergy betweenα-L-arabinofuranosidases,endo- 1,4-β-xylanases,andβ- xylosidase activities [J].Biotechnology and Bioengineering,2003,81(6):726- 731.

[15] THIBAULT J-F,RENARD C M,AXELOS M A,et al.Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid hydrolysis [J].Carbohydrate Research,1993,238(93):271- 286.

[16] BLUMENKRANTZ N,ASBOE-HANSEN G.New method for quantitative determination of uronic acids [J].Analytical Biochemistry,1973,54(2):484- 489.