食品中微生物检验技术探讨

□ 王 英 黄山市食品药品检验中心

食品中微生物检验技术探讨

□ 王 英 黄山市食品药品检验中心

微生物与人类的关系非常密切，绝大多数微生物对人类有益，但其中有一少部分微生物可引起人类的疾病。“民以食为天”，食品在生活中扮演着不可缺少的角色，食品中的微生物检验是食品检验中重要的一环。熟练掌握微生物检验技术，能提高检验人员的专业素质，保证检验结果的准确性和可靠性，还可以为生产企业做好食品质量控制提供科学依据。

微生物；检验技术；食品

随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，人们对视频的要求不在只是裹腹之物，还有更多的要求，近几年我国食品安全问题不断出现，随之食品安全问题成为大家关注的重中之重。随着食品安全法的实施，食品标准发生了很大的变化，食品质量分析的重心逐渐偏向卫生指标，如污染物限量、农药兽药残留、食品添加剂及微生物检验。微生物检验是衡量食品“卫生”的重要指标，是衡量食品卫生状况及是否能食用的重要依据。食品微生物检验结果从侧面反映出食品加工环节的一些现状，为食品监督管理工作提供一定的科学依据。目前国家卫生标准中主要检验项目有菌落总数、大肠菌群、致病菌、霉菌和酵母等，本文从微生物检验的各环节分析，从而达到对微生物检验结果良好的控制。

1 微生物的基础知识

1.1 基本概念

微生物是一些肉眼看不见的、低等的、原始的微小生物的总称。微生物在自然界的分布很广，到处都有它的存在，微生物种类多、繁殖快、代谢类型多、活性强、适应性强且易变异的特点。了解细菌的形态和结构特点，有助于人们更好的鉴别细菌，也为了解细菌的致病性和消毒灭菌打下基础。

1.2 细菌的形态和结构

细菌的个体很小，一般要借助显微镜才能观察到。细菌的基本形态有球菌、杆菌、螺旋菌三种，在镜检时就可以根据不同细菌形态鉴别。

细菌细胞的结构有一般结构和特殊结构，一般结构是任何细菌都具有的结构，特殊结构则是某些细菌所特有的结构，在细菌的分类鉴定中有重要的意义。细菌的特殊结构有鞭毛、荚膜和芽胞等。①鞭毛是长的丝状物，它是细菌的运动器官，鞭毛的数目和排列方式可作为细菌分类的依据。通过特定的染色方法，加大直径，就可在显微镜下观察到。②芽胞是杆菌发育到一定程度在细胞内形成的特殊构造。对外界环境有很强的抵抗力，一般在消毒灭菌时，必须达到消灭芽胞为标准。③荚膜是细胞壁外一层较厚的粘液性物质，它的生理功能是增强细菌的致病力、养料贮藏库、堆积废物、抵抗干燥。

1.3 微生物的生长繁殖

细菌生长所需的主要营养物质有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。水提供细胞生长需要的氢和氧，碳源和氮源提供细菌生长需要营养元素。在微生物检验过程中，选择适当的培养基让所检验的细菌更好的生长，有利于细菌计数、分离和鉴别。细菌的生长还需要控制一些其他因素，譬如细菌生长最适宜的酸碱度为7.2～7.6（个别细菌为pH8.0），温度大都为36℃（也有28～42 ℃），细菌生长的气体有氧气和二氧化碳，主要看细菌是需氧型还是厌氧性，或者兼性厌氧。

细菌的繁殖主要以简单的二分裂法繁殖，霉菌则是以孢子繁殖为主，酵母菌比较复杂，有无性繁殖和有性繁殖两种。

2 微生物检验的基本技术

2.1 灭菌和消毒、无菌操作

微生物检验操作必须是无菌操作，无菌操作指培养基经高压灭菌后，灭菌工具在无菌条件下接种含菌材料于培养基上。这意味着需要对实验器皿、培养基及一些工具要灭菌消毒。消毒指应用消毒剂杀灭物体中病原微生物的方法，灭菌指杀灭物体中所有微生物的方法。为了使灭菌后能保持无菌状态，各需灭菌的检验用品应放置在特定的容器内或用合适的材料（如专用包装纸、铝箔纸等）包裹或加塞。常用的灭菌方法有一下几种。

（1）干热灭菌。将灭菌的检验用品放置烘箱内，160～170 ℃维持1～2 h即可达到灭菌效果。适用于玻璃器皿、瓷器、金属物品。

（2）湿热灭菌。有高压蒸汽灭菌、煮沸消毒法、巴氏消毒法和间歇灭菌法。其中高压蒸汽灭菌是最常用的方法，在压力为1.031 05 Pa，温度在115～121 ℃保持15～30 min即可杀死各种微生物。适用于耐高热和不怕潮湿的物品，如培养基、生理盐水、玻璃器皿、金属物品等。

（3）灼烧灭菌。指直接在火焰上烧灼灭菌，接种针、接种环、试管口、瓶口和剪刀镊子可采用此法。

（4）辐射灭菌。有紫外线、β射线、γ射线。紫外线的穿透力弱，只适用于消毒直接照射的物体表面及空气。一般无菌室、净化工作台的空气消毒用紫外线杀菌。

（5）过滤除菌。指利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于热不稳定的药品溶液或原料的除菌。

（6）消毒剂杀菌。凡是可以杀死致病菌和有害微生物的化学药品都是化学消毒剂。消毒剂主要用于皮肤表面和台面等物体表面消毒。一般来多消毒剂的浓度越大，作用时间越长，杀菌力越强。但酒精除外，体积分数为75%浓度杀菌效果最好。

2.2 培养基制备技术

在实验室配制的适合微生物生长繁殖和累积代谢产物的任何营养基质称为培养基。根据培养基的物理状态分固体培养基、液体培养基、半固体培养基。液体培养基主要用于增菌培养、鉴别性培养；固体培养基用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物鉴定等；半固体培养基用来观察微生物动力，有时也用来保藏菌种。根据培养基的用途分通用培养基、增菌培养基、选择培养基和鉴别培养基。

培养基的制备用水在GB4789.28-2013中有明确的要求，培养基的分装也有一定要求，固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内，以不超过其容积的1/2为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。目前培养基不限于实验室自己配制，也可选择购买培养基成品，不同的培养基成品有不同的配制和灭菌方法，应该严格按照说明书操作。对首次使用的培养基应进行质量测试。

在实验过程中，存在培养基配制量偏多，可以放置于冰箱内下次使用。当然不是无限期的保存，一般基础培养基不能超过两周，生化试验培养基不宜超过一周，选择性或鉴别性培养基最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3 d。每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称、配方来源及批号、灭菌温度和时间、制备日期和制备者等信息[1]。

2.3 接种、分离和培养技术

微生物的接种方法很多，有划线法、涂布法、倾注法、穿刺法、浸洗法和点值法等，要根据不同的目的选择不同的接种方法。不同的接种方法使用不同的接种工具，比如移液枪、接种针、接种环和涂布棒等。选择适合某种微生物生长的条件或加入抑制剂抑制其他微生物的生长，从而淘汰不需要的微生物的过程称之为分离培养。值得指出的是分离纯化的过场要经过一系列的过程才能得到。

2.4 染色和镜检技术

经过分离纯化的微生物还要经过结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，需要掌握染色和镜检技术。微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法。最常用的革兰氏染色法就属于复染色法，它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过革兰氏染色可以把细菌分成两类：革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-，阳性菌和阴性菌染色结果的区别为阳性菌体呈紫色，代表菌有葡萄球菌、乳酸菌和李斯特菌；阴性菌体呈红色，代表菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和假单胞菌。革兰氏染色法包括四个步骤：初染、媒染、脱色、复染。

染色后的样本经过干燥后可用显微镜观察，显微镜使用时先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察，值得注意的是换上高倍物镜后禁止向下转动粗准焦螺旋。用显微镜观察时，往往会由于操作过程中不慎沾染上污物，在视野中形成污点，影响观察效果。因此需要及时判断污点的位置以便于尽快将其清除。视野中出现的污染物不外乎三个位置：物镜镜头、目镜镜头和装片。

2.5 鉴定技术

微生物的鉴定技术除了前面所说的染色镜检，还要对培养特性的观察，主要从菌落特征、斜面和液体培养的特征、半固体穿刺培养的特征来鉴定微生物的重要形态，这就是微生物检验中的生理生化试验和血清实验。在这里需要注意的是不论是生化鉴定还是血清分型都必须使用纯培养物。

3 微生物检验的采样

在食品检验中，采样时至关重要的，所采集的样品必须具有代表性。样品的采取、保存及运输是否恰当，直接影响检验结果的正确性。微生物的样品采集需注意一下几点。

①采样必须在无菌操作下进行，采样用具及容器必须经过灭菌，防止一切可能的外来污染。②采集后的样品应立即送检，运输过程应保证样品的完整，样品送至化验室若不能及时检验，应置于冰箱暂存。③采集的样品应及时准确的记录和标记。

随着食品标准的更新，大部分食品的采样方案已经变成二级或三级方案。二级方案设有n、c、m值，即为n个样品中，允许至多c个样品检验值大于m值；三级方案设有n、c、m、M值，即为n个样品中，允许全部样品检验值小于m值，允许至多c个样品检验值在m和M值之间，不允许有样品的检验值大于M值。

4 微生物检验过程

食品样品的检验应按照食品安全相关样品前处理标准、检验方法标准的规定检验。2017年6月23日起，GB4789更新一些常用的检验方法标准，比如GB4789.1总则、GB4789.2菌落总数、GB4789.3大肠菌群、GB4789.4沙门氏菌和GB4789.10金黄色葡萄球菌都在此次更新范围内，GB 4789.15霉菌和酵母的计数在2017年4月19日已经实施[2]。

除了检验方法标准之外，还应该知道样品相应的产品标准或食品安全标准，在不知样品污染情况下，一般根据检验项目的限量值来选择合适的稀释度。比如某样品菌落总数不得超过105CFU，可以选择10-1、10-2、10-3共3个稀释度，因为只要在10-3平板上计数超过100，该样品菌落总数就不符合要求了。

5 结语

由于食品中所含的微生物较多，产生影响因素也很多，为了提高检验质量，应该注意一下几点：①食品的采样工作是最为重要的，它直接影响检验结果的正确性，检验结果还关系到生产企业的经济效益、消费者的切生利益与安全.②食品微生物检验部门生物安全工作尤为重视，在检验工作过程中不仅要避免出现样品污染，还要防止出现检验人员感染病原菌的问题。定期对检验环境清洁消毒，检验工作产生的废弃物要统一处理。③由于微生物检验过程中需要检验人员有良好的分析能力与判断能力，所以检验人员要掌握一定的技术原理，并严肃对待检验工作，保证微生物检验的工作质量。

[1]解庆先,王燕玲.糕点糖果检验技术[M].北京:中国计量出版社,1993.

[2]万萍.食品微生物基础与实验技术[M].北京:科学出版社,2004.