烟曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶在分子调控及真菌感染中的作用

张曦 韩黎

(中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监控中心，北京 100071)

·综述·

烟曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶在分子调控及真菌感染中的作用

张曦 韩黎

(中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监控中心，北京 100071)

烟曲霉是最为常见的重要病原真菌之一，可引起侵袭性曲霉病、变应性支气管肺曲霉病、曲霉肿以及严重过敏性哮喘等多种疾病，病死率高。β-1,3-葡聚糖是烟曲霉细胞壁的主要骨架成份，也是重要免疫原性因子，由β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，该酶主要由催化亚基Fks蛋白和调节亚基Rho1蛋白组成，Rho1可利用自身活性状态转化和修饰调控β-1,3-葡聚糖的合成，也可能通过控制肌动蛋白骨架重排影响Fks胞内转位和功能。该文对β-1,3-葡聚糖的合成的分子调控机制与烟曲霉及其他病原真菌感染进行综述。

烟曲霉;β-1,3-葡聚糖;天然免疫应答;Rho蛋白

烟曲霉是最为常见的重要病原真菌之一，可引起侵袭性曲霉病、变应性支气管肺曲霉病、曲霉肿以及严重过敏性哮喘等多种疾病，每年患病人群约千万，其中侵袭性曲霉感染，严重破坏肺组织，病情进展迅速，目前缺乏有效治疗策略，病死率高 (可高达90%)[1]。细胞壁是烟曲霉细胞外骨架，其主要功能是维持细胞形态和构成首要物理屏障，同时在诱导宿主天然免疫应答过程中发挥重要作用[2]。β-1,3-葡聚糖是烟曲霉细胞壁的主要骨架成份，也是重要的免疫原性因子，可通过宿主细胞表面dectin-1等受体诱发吞噬和炎症因子释放等天然免疫应答[3]。烟曲霉β-1,3-葡聚糖由一种β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，该酶主要由催化亚基Fks蛋白和调节亚基Rho1蛋白组成[4]。另外，由于哺乳动物细胞没有细胞壁，也没有β-1,3-葡聚糖合成酶，因此该酶是很好的抗真菌药作用靶点，如棘白菌素类药物 (卡泊芬净等)，然而遗憾的是，目前真菌对该类药物的耐药性正在上升而且此类药物存在高浓度时疗效却不佳等问题[5]。因此，研究解析β-1,3-葡聚糖合成的分子调控机制对有效应对烟曲霉及其他病原真菌感染十分重要。

1 Fks蛋白是烟曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶的催化亚基

烟曲霉细胞壁的90%是由多糖组成，核心骨架是β-1,3-葡聚糖和几丁质，在此基础上链接α-1,3-葡聚糖、半乳甘露聚糖 (Galactomannan，GM)以及相关蛋白组成了烟曲霉细胞壁的三维立体结构[6]。已有研究表明，β-1,3-葡聚糖是烟曲霉重要免疫原性因子，能够与宿主细胞表面dectin-1、TLR2等受体结合，激活宿主细胞内炎症信号通路，如转录因子NF-κB通路等，进而调控细胞吞噬、炎症因子表达与释放，在烟曲霉感染宿主过程中发挥重要免疫调节作用[3]。

目前公认β-1,3-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，该酶主要由催化亚基Fks和调节亚基Rho1组成，但也可能有其他蛋白的参与[6]。酵母样真菌，如酿酒酵母、念珠菌等的Fks蛋白一般有3种亚型，功能有交叉和冗余[7]；而大多数丝状真菌，如烟曲霉只含有1个Fks蛋白。该蛋白嵌合于细胞膜 (16次跨膜)，大小为218 kD，其可利用细胞膜内的尿核苷二磷酸葡萄糖 (UDP-Glucose，UDPG)为底物合成链状的β-1,3-葡聚糖，并将其送入膜外的细胞壁空间中[8]。

烟曲霉Fks蛋白中心区域是一个位于胞浆一侧的包含约580氨基酸的较为保守的亲水区，人们推测这可能是β-1,3-葡聚糖合成的重要功能位点，但有趣的是这一区域并不包含公认的UDPG结合位点[9]；Fks蛋白的C末端则可能是与Rho1或其他因子相互作用的区域；另外，Fks蛋白的S678P突变可能导致烟曲霉对棘白菌素药物产生耐药，提示该位点可能在调控β-1,3-葡聚糖合成功能中发挥重要作用[10]。

另外，真菌细胞内Fks分布变化较为复杂且影响其催化活性。在白念珠菌中，Fks多位于细胞极性生长点附近，且与肌动蛋白斑块共定位在一起[11]；酿酒酵母Fks以无活性状态从高尔基体被转运至细胞膜上与Rho1相结合时，才被激活；还有细胞壁应激条件，如温度、渗透压、去垢剂SDS以及细胞壁干扰剂等可能通过酿酒酵母细胞壁感应受体Wsc及其下游通路调控Fks的分布和活性，如当细胞壁破损时，Fks可从细胞生长点向细胞壁损伤区域转位[12]。

2 Rho1蛋白是烟曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶的调节亚基

多种因子可能参与调控Fks催化合成β-1,3-葡聚糖，其中最为重要的是β-1,3-葡聚糖合成酶的调节亚基Rho1[6]。它是小G蛋白Rho家族成员之一，鸟苷酸交换因子GEF蛋白可促进其活化 (结合GTP)，GTP水解酶GAP可促进其失活 (结合GDP)；Rho-GDI分子可使其保持在结合GDP的非活性状态。在哺乳动物中Rho家族有Rho、Rac、Cdc42 3个亚家族，是细胞形态变化、细胞运动、囊泡运输等重要生理过程的调控核心；而烟曲霉有6个亚型，Rho1-4，Rac1 (仅在丝状真菌中)和Cdc42。Rho1蛋白既是真菌极性生长和形态变化的调节核心，又调控Fks活性影响细胞壁β-1,3-葡聚糖合成。首先，它直接与Fks结合，利用自身活性状态转化和修饰调控β-1,3-葡聚糖的合成[13]。粟酒裂殖酵母细胞膜上的Rho1可以被Rgf (一种Rho-GEF蛋白)激活，促进与Fks的结合和β-1,3-葡聚糖合成[14]；而酿酒酵母中Lrg1P (一种Rho-GAP蛋白)则抑制Rho活性进而抑制Fks功能[15]；酿酒酵母Rho1的异戊烯基化对其经囊泡运输转运至细胞膜并与Fks结合至关重要[16]；但是烟曲霉中Rho-GAP以及GDI蛋白对β-1,3-葡聚糖合成的影响尚未见报道。其次，Rho可激活蛋白激酶C (PKC)，进而激活有丝分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)调节细胞核内转录因子，从而影响烟曲霉细胞壁完整性。再者，SDS去垢剂处理酿酒酵母，可通过细胞壁感应受体引发Rho1激活，进而诱发肌动蛋白骨架重排和β-1,3-葡聚糖的合成[17]。具体到烟曲霉，其Rho1蛋白大小约21 kD，与酿酒酵母Rho1同源性为85%。与酵母Rho1不同，烟曲霉Rho1蛋白的异戊烯基化位点中的异亮氨酸被极性苏氨酸代替[8]。

3 Rho1控制的肌动蛋白骨架重排可能影响Fks胞内转位和功能

在酿酒酵母中，Fks的胞内转位取决于肌动蛋白骨架的重排[18]。比如，热应激可导致Fks的去极性化分布 (由细胞极性生长点附近的肌动蛋白皮质斑块分散入细胞浆中)，而这种分布变化受控于细胞内肌动蛋白骨架重排，且与细胞膜上的细胞壁应激感应受体Wsc有关[12]。更进一步，人们已知哺乳动物细胞肌动蛋白骨架的重排直接受控于一种肌动蛋白骨架解聚因子-Cofilin蛋白[19]。该蛋白广泛分布于各类真核细胞中，作为Rho家族蛋白下游信号蛋白，其可直接与单体肌动蛋白或肌动蛋白丝结合，解聚肌动蛋白骨架，控制其组装与重排。Cofilin的N末端首位丝氨酸的磷酸化循环 (被LIM激酶磷酸化而失活，被磷酸水解酶Slingshot去磷酸化而恢复活性)是其主要功能开关。在裂殖酵母中，Cofilin功能缺陷可引起细胞膜下肌动蛋白斑的组装和解聚明显减慢，导致胞吞过程受到抑制[20]；酿酒酵母Cofilin可以调节高尔基体囊泡运输货物的分选和输出等[21]。另外，我们前期发现，哺乳动物细胞中Cofilin可以结合并激活另一种重要胞内信号蛋白-磷脂酶D (PLD)，介导Rho蛋白调控的肌动蛋白骨架重排[22]；哺乳动物细胞中，磷脂酶D (PLD)可水解细胞膜磷脂的重要组成成分-磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine，PC)，生成磷脂酸 (phosphotidicacid,PA)和胆碱，参与调控囊泡运输、细胞形态变化、胞吞与胞吐、呼吸暴发和炎症因子释放等重要生理过程[23]；在粟酒裂殖酵母中，PLD可调控肌动蛋白骨架重排进而控制出芽形成和减数分裂[24]；另一类重要病原真菌白色念珠菌的PLD是其双相性转化的毒力决定因子，可促进其菌丝形成[25]。值得注意的是，外源加入磷脂酶类蛋白会明显抑制植物中β-1,3-葡聚糖 (Callose,胼胝质)的合成[26]。因此，烟曲霉PLD可能直接与Fks结合并影响β-1,3-葡聚糖合成，也有可能通过调控肌动蛋白骨架重排参与调控Fks功能。

4 β-1,3-葡聚糖合成与抗真菌药物

已有临床研究显示，应用棘白菌素类药物 (卡泊芬净)治疗曲霉感染患者会导致血清中GM含量升高，且给药浓度高时治疗效果却不佳[27]。最新研究发现，与传统观点相反，Fks完全敲除的烟曲霉仍可存活，并且其细胞壁中几丁质含量显著升高，半乳糖甘露聚糖从细胞壁上的解离也显著增多[28]。这一结果从一定程度上解释了前面的临床现象。另一方面，几丁质和半乳糖甘露聚糖也是重要病原模式相关分子[29]。粗糙脉胞菌中，具有抑菌特性的壳聚糖能导致β-1,3-葡聚糖合成 (fks)与延伸 (gel-1)相关基因表达的显著降低，同时缺陷株 (Δgel-1与Δgel-2)对壳聚糖敏感性升高，而几丁质缺陷株 (Δchs-1)则没有[30]。念珠菌中对生物膜形成的研究发现，Fks突变株虽然对棘白菌素药物产生耐药，但并不影响生物膜的形成。而两性霉素B则能显著影响Fks突变株生物膜的形成，却并不影响其他本质上对棘白菌素药物产生耐药的菌株[31]。

5 展 望

目前β-1,3-葡聚糖合成的调控机制已有较多研究，尤其在酿酒酵母和粟酒裂殖酵母中人们对Rho-GEF蛋白调控Rho活性和影响β-1,3-葡聚糖合成的现象有较多报道，但对Rho1自身到底如何与Fks结合，在哪个区域结合，如何调控的具体分子机制仍不清楚。且烟曲霉Rho1的GAP蛋白和Rho-GDI等抑制因子对β-1,3-葡聚糖合成的影响也不清楚。这些问题的解答将为寻找可能的药物靶点奠定重要基础。另外，烟曲霉β-1,3-葡聚糖合成的改变，不仅仅影响细胞壁β-1,3-葡聚糖的含量，还有可能改变细胞壁其他多糖组成，引起不同于β-1,3-葡聚糖的宿主天然免疫应答的变化。这些变化在整体水平 (动物)上意义如何，都是非常值得研究探索的问题。

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Molecularregulationonbiosynthesisofβ-1,3-glucanoncellwallofAspergillusfumigatus

ZHANG Xi,HAN Li

(DepartmentofHospitalInfectionControlandResearch,InstituteofDiseaseControlandPreventionofPLA,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

As a major pathogenic fungus,Aspergillusfumigatusis able to cause the invasive pulmonary aspergilosis with high mortality,or chronic infection and allergic disease.β-1,3-glucan is not only the back-bone of cell wall ofA.fumigatus,but also an essential immunogenic factor.β-1,3-glucan synthase is composed of a catalytic subunit,Fks and regulatory subunit,Rho1.Rho1 can bind to Fks and regulate the synthesis of β-1,3-glucan through the transformation and modification of its active state.It also may affect cellular translocation and function of Fks by controlling the actin cytoskeleton rearrangement.

Aspergillusfumigatus;β-1,3-glucan;innate immune response;Rho-GTPase

[Chin J Mycol，2017，12(5):309-311]

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0309-03

国家自然科学基金 (31400134)

张曦，男 (汉族)，博士研究生在读.E-mail:zhangxi0820@126.com

韩黎,E-mail:hanlicdc@163.com

2017-02-13

[本文编辑] 施 慧