镁合金内皮细胞相容性研究

镁合金内皮细胞相容性研究

【作 者】温贤涛1,2，贺学英1,2

1 北京市医疗器械检测所， 北京市，101111

2 医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室，北京市，101111

血管再狭窄是血管支架应用中存在的主要问题之一，而血管支架植入后迅速内皮化对解决血管再狭窄问题起着至关重要的作用。近年镁合金支架研究是可降解血管支架研究中的热点之一，材料与内皮细胞相容性是镁合金材料研究中的关键点之一。该文综述了近年镁合金与内皮细胞相容性研究，介绍了主要研究方法、影响内皮细胞相容性的因素、研究存在的不足及以后的研究方向。

镁合金；内皮细胞；细胞相容性

【 Writers 】WEN Xiantao1,2, HE Xueying1,2

1 Beijing Institute of Medical Device Testing, Beijing, 101111

2 Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing and Safety Evaluation, Beijing, 101111

【 Abstract 】In-stent restenosis is a main problem in the application of stents. It has been proved that rapid endothelialization of stents after implantation is the key point for solving the problem of restenosis. Recent years researchers focus on developing biodegradable magnesium alloy stents. The cytocompatibility is essential for the design of magnesium alloy stents. In this article, recent research about the endothelial cytocompatibility of magnesium alloy was reviewed, including methods, results, shortcomings and advice.

0 引言

血管支架植入已成为解决血管狭窄性病变的重要手段之一。目前不锈钢、镍钛合金及钴铬合金的支架已广泛应用于临床，但是支架植入后血管再狭窄问题却成为支架临床使用中亟待解决的问题。血管再狭窄的主要原因是不可降解支架作为永久植入物，长期刺激血管壁，导致血管功能紊乱和血管内膜增生，从而导致血管再狭[1]。一般认为支架植入后迅速内皮化及抑制平滑肌细胞的生长能降低血管再狭窄率[2]。研究人员在这一方面做了大量的工作，目前已开发出药物释放支架，释放抑制平滑肌细胞生长的药物，防止支架植入部位再狭窄，但是再狭窄问题仍未得到根本解决。可降解支架的概念被提出来后，研究人员希望这种支架在完成一段时间的力学支撑后能逐渐降解消失，解决永久植入支架对血管造成刺激的问题，从而解决血管再狭窄问题[3]。目前可降解血管支架研究中镁合金支架是最有前景的研究方向之一，但仍存在的降解速度过快及力学性能较差等问题[4]。为了提高抗腐蚀性能及力学性能，研究人员致力于镁合金材料的优化，包括对镁合金成分优化和对镁合金表面进行处理。镁合金材料在理化性能得到优化的同时，是否能促进内皮细胞生长和迁移也必须考虑，这直接影响到镁合金支架植入后能否迅速内皮化，进而防止后期血管再狭窄的发生。本文综述了近年镁合金内皮细胞相容性的相关研究，总结主要研究方法、研究结果、分析影响因素及提出以后的研究方向。

1 主要研究方法

镁合金内皮细胞相容性研究方法主要是采用体外细胞培养的方法，将内皮细胞与镁合金或镁合金浸提液进行接触，培养一定时间后，对细胞生长的各项指标进行评估，如细胞活性及增殖，细胞凋亡及坏死，细胞粘附与迁移以及相关基因的表达等。

目前常用于研究的内皮细胞有人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），人冠状动脉内皮细胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells，HCAECs）及人主动脉内皮细胞（Human Aorta Endothelial Cells，HAECs），也有融合细胞株如EA.hy926[5]。细胞种类的选择应该与材料研究的目的相匹配，对于血管支架内皮化的相关研究，应该首选内皮细胞。有些研究者并未使用内皮细胞进行细胞相容性的研究，而是选用其它细胞，如成纤维细胞等[6]。所得出的结果最多只能作为初步的细胞毒性筛选，不能预示材料是否有良好的内皮细胞相容性。

细胞活性及增殖主要采用的方法有MTT法检测细胞活性，LDH法检测细胞毒性、BrdU检测细胞增殖等。MTT法中MTT为二甲基噻唑二苯基四唑溴盐，能被活细胞摄取，并在线立体中被脱氢酶还原成甲瓒，而死细胞没有这种功能。用二甲亚砜将甲瓒溶解出来，测其吸光度，从而推测细胞的活性，因此MTT法间接反应了活细胞的数量。LDH法检测细胞毒性的原理是LDH（乳酸脱氢酶）是稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度。LDH法反映材料对细胞损伤的情况。BrdU法中BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，能在细胞合成期掺入到DNA中去，因此通过一些方法测得掺入到DNA中的BrdU含量能间接反映细胞增殖情况。Zhao等[7]认为溶液pH值偏碱性或含过多Ca离子时，MTT法可能出现假阳性。相比LDH和MTT法，BrdU法更适合镁基材料细胞相容性研究，因为在研究某些离子对细胞作用时BrdU法更敏感。

细胞凋亡与坏死一般使用专门的检测试剂盒，其原理是凋亡的细胞和坏死的细胞被不同的染料染色，然后用流式细胞仪分选或免疫荧光仪进行观察，可以得到细胞凋亡和坏死的比例数据或直观图片信息。

细胞粘附及形貌可采用扫描电镜（SEM）观察或免疫荧光方法观察。SEM观察需要先对样品进行固定、脱水及喷金等处理程序后，再进行观察。而免疫荧光观察方法，则是用染料对细胞中相关蛋白或DNA进行染色，在免疫荧光仪下观察细胞生长状态，能直观地看到亚细胞结构。

细胞迁移可采用刮痕法，当内皮细胞在培养板中形成单层覆盖时，用毛细玻璃在培养板中划一条直线，培养板上形成一条无细胞生长的空白带状区域，继续培养一定时间后，在相差显微镜下观察细胞向空白区域迁移的情况，并根据带状区域宽度或面积的变化计算细胞的迁移速率[7-8]。相应计算公式为，RR=(initial gap width-current gap width)/(initial gap width) 和 RS=RR/time，其中RR为再覆盖率，RS为再覆盖速率。

相关基因表达主要采用RT-PCR方法，提取组织或细胞中的总RNA，以其中mRNA作为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。目前镁合金对内皮细胞基因表达影响的研究主要涉及血管发生、细胞粘附、炎性反应、血小板激活等相关基因[7,9]。

2 主要研究结果

镁合金支架材料研究主要集中在镁合金成分优化及镁合金表面改性，目的在于提高镁合金力学性能和抗腐蚀性能力[10]。对于镁合金成分的优化，除了Al, Zn, Ca, Li, Sr, Mn等元素外，在镁合金中加入稀土元素是近年的研究热点。目前大部分的研究表明加入稀土元素后，镁合金有更好的内皮细胞相容性。Zhao[11]等研究了四种含有不同成分稀土元素(Y, Gd, Dy, Nd)的镁合金与人主动脉内皮细胞（HAECs）的相容性，用材料的浸提液与细胞接触，结果显示四种稀土镁合金都比纯镁对照表现出更好的内皮化性能，并发现在内皮细胞粘附的早期Dy离子可能对粘附有抑制作用。Ge[8]对含有稀土元素的镁合金（Mg-Y-Nd-Zr）进行人脐静脉内皮细胞（HUVECs）相容性研究，同样用镁合金浸提液与细胞接触，进行细胞粘附和细胞迁移的研究，结果也显示含稀土元素的镁合金比纯镁更利于细胞的粘附。相比纯镁，镁合金抗腐蚀性能明显提高，降解产物的产生速率和pH升高都相对放缓，更有利于内皮细胞粘附与迁移。Horie M[12]等发现金属降解产物可能会诱导ROS产生。Carins R A[13]等认为ROS在低浓度时促进细胞增殖，但是高浓度时会破坏DNA和其他生物大分子，导致增殖下降甚至细胞凋亡。Wang等[14]研究认为稀土元素能有效促进内皮细胞合成NO，这将有利于支架内皮化。

少量的研究者进一步研究了镁合金成分离子对细胞的影响。目前研究表明10 mmol/L Mg离子浓度是适合内皮细胞增殖及迁移的浓度。Zhao[7]与 Maier JA[15]的研究都发现10 mmol/L MgCl2能刺激内皮细胞增殖。Katrin S[9]的研究认为10 mmol/L Mg离子时，对内皮细胞基因表达影响最小。Banai[16]的研究认为4 mmol/L Mg离子能促进细胞迁移。Zhao还发现当MgCl2高于40 mmol/L 时，细胞活性及迁移受到明显影响，这结果与Andreas D[17]的研究结果相近。Mg离子是人体内含量第四的离子，参与人体的生理和代谢过程，影响细胞的离子转运及调控信号传递等。离子浓度的改变可能导致信号通道改变，这些通道可能与细胞周期、酶活性下降及DNA复制错误增加相关。Zhao研究表明Mg离子能改变30多种与血管再生和细胞粘附信号通路相关的基因表达。此外，Zhao还研究了其它成分离子对内皮细胞的影响，如Ca, Zn, Al及稀土元素Y, Dy, Nd, Gd等对细胞活性的影响。结果显示Zn离子的半数有效浓度为130 μmol/L 左右，Al离子为2.4 mmol/L 左右，而四种稀土元素半数有效浓度则在710 μmol/L 到990 μmol/L 。研究还认为与平滑肌细胞和成骨肉瘤细胞相比，内皮细胞对稀土成分更敏感。

除了对镁合金合金成分种类及含量进行不断优化，研究者们还对镁合金进行表面改性来提高镁合金理化性能及生物相容性。表面处理方法主要包括改变表面成分和微结构，如进行氟化处理，微弧氧化处理等。或者在合金表面再增加新的覆盖层CaP沉积层，PEO、PTMC、PCL等有机膜层。Zhao[18]及Andreas D[17]分别研究了不同镁合金氟化处理后与内皮细胞的相容性，结果显示氟化处理后的镁合金更利于内皮化。一般认为氟化处理后，镁合金降解速度变慢，pH值变化更小，氢气产生量也更少，因此更利于细胞的粘附及迁移。Zhang[19]认为氟化处理后，镁合金表面Zeta电位相比未处理前更低，表面亲水性能提高，这可能也是细胞相容性提高的原因之一。除了优化镁合金降解性能，一些研究者还开发出药物释放镁合金支架，装载抗凝血或抑制平滑肌生长的药物[20]。紫杉醇是已被作为抑制平滑肌生长的药物用于药物释放支架。除了紫杉醇，Zhang[21]对载有阿魏酸（Ferulic acid，FA）的镁合金支架进行研究，结果显示FA能促进HUVECs的粘附、迁移及增殖。Zhang认为FA能有效地抑制氧化应激（Oxidative stress）引起的损伤而导致的NO减少或促进内皮细胞合成并释放NO。一般认为氧化应激会损伤内皮细胞，影响细胞的迁移，从而影响内皮化过程。NO是调节内皮细胞功能的重要介质，被视作内皮细胞的存活因子。NO能及时地清除过氧化物和防止由于氧化应激导致的内皮细胞凋亡，同时NO还能促进细胞迁移和调节血管再生。此外，Zhang 认为载药膜的厚度和载药量对促进内皮细胞生长也有影响，并指出目前已上市的药物释放支架表面的药物载体膜可能太薄，厚度只有20 μm左右，从中释放出来的药物不能维持长期促进内皮细胞生长的作用。

3 研究的不足与未来的方向

细胞相容性研究为体外实验，其优点是经济省时，是生物材料研究过程中重要的初筛手段，也是一些机理研究的必要手段。但体外实验值得考虑的问题是结果能否真实地反应体内的实际情况。体外实验通常不可能完全模拟体内复杂的环境，导致体外研究结果与体内研究结果存在差异。例如内皮细胞相容性研究多是在培养板中静态进行，而镁合金支架植入到血管后，镁合金表面处于血流动态环境中。又如大多数体外实验中镁合金材料制作为片状，或者使用镁合金的浸提液，而与实际应用时性状相差很大。再如研究镁合金释放出的离子对内皮细胞的影响时，大多是对单一离子进行研究，而体内环境中各种离子共存，并同时对细胞起作用，较体外复杂得多。因此我们在使用前人的体外研究结果时应该慎重，尽可能地寻找体内的研究数据进行支持。在设计实验和对实验结果进行解释时，也应该充分考虑这种差异。

一般来说材料本体性质影响材料的功能和使用期限等，而材料表面性质则会影响到材料与机体的生物学效应，如表面的化学成分、表面形貌、表面粗糙度、表面电荷及表面能等。此外，对于可降解材料还应该考虑降解产物的影响。目前关于镁合金内皮细胞相容性研究还不多，也不够深入，还有许多方面需要开展深入的研究。例如镁合金表面形貌，表面粗糙度、表面电荷及表面能等对内皮细胞生长迁移的影响。这些研究结果能更好的指导镁合金材料研究者调整优化方向。

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Research on Endothelial Cytocompatibility of Magnesium Alloy

magnesium alloy, endothelial cells, cytocompatibility

R318

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.02.012

1671-7104(2017)02-0120-03

2016-08-17

温贤涛，E-mail: wenxiantao@bimt.org.cn