发酵法产丁醇的研究进展

王洪，罗惠波，2*，廖玉琴，邓露，刘蔺，李芬

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

发酵法产丁醇的研究进展

王洪1，罗惠波1，2*，廖玉琴1，邓露1，刘蔺1，李芬1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

近年来，由于国际市场油价大幅上升和供应不稳定，并且环境污染问题日益突出，利用可再生原料发酵产丁醇受到广泛关注，丁醇作为一种清洁可持续的燃料用于能源工业具有诱人的潜力和前景。但目前丁醇生产成本较高，主要表现在原料成本高和产物浓度低两个方面。该文从非粮生物质原料的选择、选育或构建高产丁醇的菌株、发酵丁醇的分离及新工艺的选择等方面综述生物发酵生产丁醇的现状，旨在为降低丁醇生产成本提供参考，进而推动生物法丁醇产业的发展。

丁醇；发酵；菌株；原料；工艺

丁醇发酵已有上百年的历史，可追溯至1861年[1]。传统丁醇的生产是利用梭状芽孢杆菌属（Clostridium）菌株，通过丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）发酵途径而得到，一般溶剂中丁醇、丙酮和乙醇比例为6∶3∶1（V/V），现报道的三组分发酵溶剂中丁醇可占到7/10[2]。在第一次世界大战期间丁醇被大量用来生产橡胶，因此，以粮食淀粉质为原料的丁醇发酵工业得到迅猛的发展，但到了20世纪50年代，由于石油产业的冲击，被成本低廉的化学合成法逐渐取代[3]。丁醇的化学合成法主要有①羰基合成法，其过程为丙烯与CO、H2在高温高压及催化剂存在的条件下合成丁醛，加氢后得到丁醇，这也是工业上主要的合成丁醇的方法。②醇醛缩合法，其过程为乙醛经缩合后形成丁醇醛，经脱水后生成丁烯醛，加氢后得丁醇。然而，直到20世纪70年代，石油危机的出现把人们的目光重新聚焦到发酵法产丁醇上。但是，原料成本高和产物浓度低一直制约着发酵法产丁醇的发展。目前，国内外研究者主要通过三个方面对这个问题进行解决：一是选择非粮生物质原料及探索其预处理方法；二是通过分离、诱变、筛选、基因工程技术修饰等获得高产或高丁醇耐受性菌株；三是解除产物（丁醇）抑制作用。随着现代社会出现的温室效应，环境污染，能源紧缺等问题，发展清洁可持续的生物燃料是能源工业的未来发展方向，而丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料。本文从非粮生物质原料的选择、选育或构建高产丁醇的菌株、发酵丁醇的分离及新工艺四个方面对生物发酵生产丁醇现状进行综述，旨在为降低丁醇生产成本和提高丁醇浓度提供参考，进而推动生物法丁醇产业的发展。

1 丁醇的特性

丁醇（CH3CH2CH2CH2OH）在常温下呈液态，其分子质量为74，密度0.810 9 kg/L，熔点-88.9℃，沸点117.7℃，溶解度为7.7%（20℃）。相对于乙醇来说，丁醇具有较高的内能（35.103 MJ/kg），丁醇的热值大约为汽油的83%，而乙醇的热值却只有汽油的65%，且丁醇的挥发性远低于乙醇，仅为其的1/6[4]。此外，还具有与汽油配伍性较好、腐蚀性低、污染轻等特点[5]。

2 生物发酵法产丁醇

随着石油资源的枯竭和温室效应等环境问题的日益突出，以石油资源为原料的丁醇化学合成法会对环境造成污染，且能耗高，已经不能适应目前丁醇的生产工艺，以可再生的生物质原料生物发酵产丁醇是未来的趋势。选择合适的原料和筛选或构建高产丁醇的菌株，能有效地降低生产成本。

2.1 发酵原料

2.1.1 粮食原料

发酵法产丁醇的原料主要为玉米、小麦、薯类等粮食原料[6-9]。近年来，由于国内以玉米、小麦等粮食为原料的发酵行业发展迅速，尤其是酒精发酵行业，在一定程度上使得全国粮食价格快速上升，导致生物丁醇生产成本也大幅度增加。同时，国家出于维护粮价稳定和粮食安全的考虑，开始限制大规模使用粮食发展生物能源。使用廉价的非粮生物质原料是生产生物燃料丁醇的出路，其中包括作物秸秆、菊芋、甘蔗、甜菜糖蜜、制糖工业的废液等[10-11]。

2.1.2 糖质原料

菊芋、甘蔗、甜菜等是日常生活中常见的糖质原料，也被大量的用于丁醇的发酵生产。菊芋为菊科向日葵属多年生宿根性草本植物，其生态适应能力强产量高，陈丽杰等[12]对菊芋汁酸水解液发酵生产丁醇进行了初步研究，结果表明，当水解液的初始糖质量浓度为48.36 g/L时，发酵终点丁醇质量浓度为8.67 g/L。彭万峰等[13]利用丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）810705发酵甘蔗汁产丁醇进行了研究，在糖含量为7.5%、温度37℃的最佳条件下发酵得到丁醇质量浓度为15.4 g/L。范俊辉等[14]利用从土壤中筛选出的菌株丙酮丁醇梭杆菌（Clostridium acetobutylicum）2N发酵甜菜蜜糖产丁醇，在最佳发酵条件下得到丁醇和总溶剂的含量分别为14.15 g/L和19.65 g/L。虽然糖质原料发酵所产丁醇浓度较高，但原料利用率偏低，后期应着手解决这个问题。

2.1.3 纤维质原料

木质纤维素原料产量极大，且具有巨大的利用价值[15]。LU C C等[1]对木薯渣水解液发酵产丁醇进行了研究，初始水解液葡萄糖质量浓度为44.8 g/L时，通过分批发酵后得到丁醇的质量浓度为9.71 g/L，总溶剂为15.41 g/L，随后通过旋转蒸发浓缩水解液并耦合一个气提式补料分批发酵生物反应器，通过补料分批发酵使丁醇产量增至76.44 g/L，此时，总溶剂为108.5 g/L。LI X等[16]使用木薯发酵产丁醇，分批发酵后丁醇产量为11.85 g/L。潘贺鹏等[17]以工业废弃物小麦淀粉废水为辅料，补加适当营养成分进行丁醇发酵，最终丁醇和总溶剂产量最高可分别达到14.72 g/L和 22.65 g/L。程意峰等[18]选用能较好利用甜高粱秸秆汁并且高产丁醇的菌株Bacillus acetobutylicumBd3进行甜高粱秸秆汁发酵产丁醇的研究，发酵条件优化后得到丁醇的质量浓度为10.29 g/L。木质纤维质原料经水解后要进行脱毒处理，可有效的防止水解液中有害物质对菌株的抑制作用[19]。此外，由于葡萄糖的阻遏效应使得木质纤维质原料水解液中大量的木糖、阿拉伯糖等五碳糖残留，使资源浪费，同时，多数原料产丁醇浓度偏低，主要是由于底物（丁醇）的抑制作用。所以筛选或构建高产和高耐受丁醇的菌株及能兼用五碳和六碳糖作为碳源的菌株迫在眉睫。

2.2 发酵菌株

2.2.1 工业上主要发酵菌株

工业上产溶剂梭菌有四种，分别为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium bei jerinckii）、糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum）和糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum），其中丙酮丁醇梭菌是最常用且研究得最深的菌株[20]。此外，当丁醇质量浓度达到13～14 g/L时对梭菌细胞有毒害作用，并抑制其生长代谢。由于产物丁醇浓度低是制约丁醇工业发展的瓶颈之一，所以筛选和构建高产丁醇的菌株是一种有效的解决办法。

2.2.2 高产丁醇菌株的选育和构建

基于传统梭状芽孢杆菌低产丁醇的弊端，可通过野外筛选、驯化、诱变、构建产丁醇工程菌等方法得到高产和高耐受丁醇的菌株[21-27]。裴建新等[28]通过筛选、分离，从自然环境中获得一株丁醇发酵比率较高的新菌株-gxzp-13-2，用于丁醇发酵试验时，最终丁醇比率高达72.1%。LU C C等[1]通过突变和驯化得到一株丁醇高耐受性和高产的菌株C.acetobutylicumJB200，用于丁醇发酵后也取得不错的结果。由于ABE发酵代谢过程已十分清楚，溶剂的代谢过程都要先经过糖酵解（embdenmeyerhofpathway，EMP）途径，然后沿着不同的代谢方向得到不同的产物，所以可以通过阻断乙醇或丙酮的代谢途径来增强丁醇的代谢[29]。JIANGY等[24]通过将实验菌株-EA2018的丙酮合成途径的关键酶（乙酰乙酸脱羧酶）基因敲除，阻断了丙酮的合成，使丁醇的比率提升到85%以上。TUMMALA S B等[30]使用asRNA技术对丙酮丁醇梭菌进行代谢工程修饰，将丁酸激酶活性降低85%，从而使丁醇产量提高35%。此外，人们也利用基因工程技术改造大肠杆菌，得到产丁醇的大肠杆菌工程菌[31]。张艳等[32]克隆了丙酮丁醇梭状芽孢杆菌Clostridium acetobutylicumATCC824丁醇合成途径关键酶基因，构建了产丁醇的大肠杆菌工程菌，在一定的培养条件下丁醇产量最大为84 mg/L。林丽华等[33]通过克隆大肠杆菌乙酰转移酶基因atoB和丙酮丁醇梭菌丁醇合成关键酶基因crt、hbd、adhE构建表达质粒pSE380-atoB-adhE-crt-hbd，克隆齿垢密螺旋体（Treponema denticola）反式烯酰辅酶A还原酶基因ter构建表达质粒pSTV29-ter，并将双质粒导入大肠杆菌，半厌氧发酵条件下丁醇产量为80 mg/L。一般产丁醇大肠杆菌工程菌的丁醇产量还是较低，后期还要攻克这个难点，从而提高产量降低成本。

3 发酵丁醇的分离

除了通过筛选、构建高耐受丁醇毒性的菌株外，还可在发酵的同时移除丁醇，使丁醇浓度处于抑制质量浓度（11 g/L）以下[34]，以解除其抑制作用。主要的分离提取方法有萃取法、吸附法、渗透蒸发法、气提法等。

3.1 萃取法

萃取法是指在发酵的同时对产物进行萃取的方法，使用萃取剂将代谢产物（丁醇）从发酵液中萃取出来，使其浓度小于抑制浓度，从而达到消除代谢产物对菌株的抑制作用[35]。发酵与萃取相结合的工艺主要有间歇萃取发酵、原位萃取发酵、外部循环萃取发酵等几种耦合方式，在萃取发酵过程中萃取剂的选择至关重要，需要考虑萃取剂的分配系数、选择性、密度、黏度、极性、挥发性等理化性质[36]。适宜的萃取剂要求对发酵产物分离度好、对微生物尽量无毒害作用，萃取剂的选择已成为萃取发酵技术的关键点之一[37]。杨立荣等[38]使用油醇和混合醇作为丁醇发酵的萃取剂，当发酵初始葡萄糖质量浓度为110 g/L时，经过萃取发酵后总溶剂质量浓度达到33.63 g/L。潘贺鹏等[39]利用生物柴油进行萃取发酵小麦淀粉废水，与对照组丁醇和总溶剂质量浓度14.72 g/L和22.65 g/L相比，丁醇和总溶剂产量得到进一步提升，分别达到15.13 g/L和29.38 g/L。王风芹等[40]研究了以玉米秸秆水解液为原料，以油醇为萃取剂，在萃取剂添加比例为1∶1，水解液糖质量浓度为32 g/L的条件下发酵，得到丁醇和总溶剂产量为3.28 g/L和4.72 g/L。萃取发酵能提高产量，但也会对下游目的产物的提纯带来一定的影响，所以在选择萃取剂时应该将这个因素考虑进去。

3.2 吸附法

吸附法是指在发酵的同时添加硅藻土、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyridine，PVPP）等吸附剂，将发酵产物吸附在吸附剂上，除了解除产物抑制外还可延长发酵时间，从而得到较高的溶剂浓度[35，41]。NIELSEN D R等[42]以聚苯乙烯类树脂为吸附剂，利用菌株C.acetobutylicumATCC 824发酵产丁醇，在初始葡萄糖质量浓度为80 g/L，加入0.05 kg/L树脂的条件下丁醇产率与未加树脂的发酵液相比增加了83%。以PVPP为吸附剂，相比于分批发酵，吸附-分批发酵耦合工艺的ABE生产速率提高了130%[43]。添加吸附剂可以明显的提高丁醇的产率，但是溶剂和吸附剂之间存在相互作用以及吸附平衡，在实际应用中可能会存在吸附剂用量大，操作难等问题。

3.3 渗透蒸发法

渗透蒸发法是指在发酵的同时使发酵液通过一种选择性很强的渗透膜，将底物分离到膜的另一侧的发酵方式。渗透蒸发的过程，就是通过渗透选择膜，在膜两侧形成渗透压差，使发酵液中产物部分蒸发，从而达到分离与富集产物目的的一种膜分离方法[44]。渗透膜按专一性可分为亲水膜和疏水膜，在渗透蒸发法产丁醇中使用的疏水膜主要有聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）膜、偏聚氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、聚醚酰胺膜、壳聚糖-聚环氧乙烯膜、基硅氧烷膜等[45]。童灿灿[46]以PDMS/PVDF渗透汽化膜组件与丁醇发酵相耦合，总溶剂产率从对照组的0.19 g/（L·h）提升至0.44 g/（L·h）。渗透蒸发法能提高发酵效率，制备的丁醇纯度较高，但大部分渗透膜存在选择性差、稳定性差、成本较高等缺点，所以在应用时需根据情况来选择膜材料。

3.4 气提法

气提法的原理是利用发酵过程中产生的H2和CO2或者充入惰性气体（如N2）作为载气，于外在动力作用下进入发酵体系，发酵液组分被气提到气相中，从而使发酵产物及时分离。以乳糖为底物，使用菌株Clostridium acetobutylicum P262生产丁醇过程中与气提相耦合，丁醇质量浓度由不气提的8.1 g/L上升至11.0 g/L[47]。上海生物丁醇协作组通过菌株C.acetobutylicumEA 2018批式玉米醪发酵-气提耦合技术，将ABE发酵产物的质量浓度提高至30 g/L，其中丁醇20 g/L[35]。气提发酵对解除产物抑制和产物富集是一种有效的方法，但被气提出来的组分不是单一组分，往往是几种混合物，由于各组分的沸点不同，可以通过不同的加热和冷凝而得到纯的单一产物。

4 生物发酵法生产丁醇新工艺

4.1 细胞固定化发酵

细胞固定化发酵技术被应用于新能源开发、食品加工、医药行业、污水处理等领域，固定化方法多种多样，主要有吸附、交联、包埋、共价法等，载体材料包括海藻酸钙、琼脂、聚乙烯醇凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、硅藻土、氧化铝等[48]。细胞固定化发酵技术不仅可以提高生产效率，还可将细胞与产物分开，从而达到解除产物抑制的目的。除了常规的细胞固定化模式发酵产丁醇外，孔祥平等[49]对化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵产丁醇的影响进行了研究，该试验将载体甘蔗渣用聚乙烯亚胺和戊二醛进行表面化学改性，对丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumXY16进行固定化丁醇发酵试验，发酵36 h后总溶剂和丁醇质量浓度分别达到21.67 g/L和12.24 g/L，生产速率比游离细胞和未处理的甘蔗渣固定化细胞发酵分别提高130.8%和66.7%。陈强等[50]以砖块为固定化材料进行丁醇发酵试验，以5～8目砖块为固定化材料，流速1.1 L/min，发酵48 h后丁醇质量浓度、生产率分别为11.02 g/L和0.23 g/（L·h），相比悬浮细胞发酵分别提高了10.53%和9.52%，细胞固定化发酵技术作为一种高效的发酵工艺具有极大的潜力。

4.2 多菌种共发酵

多菌种共发酵技术主要用于以纤维质为原料的丁醇发酵中，在不添加外源纤维素酶的条件下，利用纤维素分解菌株和丁醇产生菌株的共同作用下获得丁醇。林逸君等[51]通过纤维小体产生菌Clostridium thermocellumATCC 27405与产溶剂菌Clostridium beijerinckiiNCIMB 8052的偶联培养，直接利用玉米棒芯产丁醇，且该产溶剂菌株能同时利用己糖和戊糖，在一定的发酵条件下还原糖积累量为37.4 g/L，最终得到总溶剂的质量浓度为16 g/L，其中丁醇8.75 g/L。共发酵工艺免去了复杂的原料预处理过程（酸水解、酶水解等），降低了预处理成本；产溶剂菌株能同时利用五碳糖，避免了资源的浪费。但是，共发酵工艺所得丁醇产量偏低，后期可以通过基因工程技术对纤维素分解菌株和产溶剂菌株进行修饰和改造以期得到高丁醇产量的菌株；也可以通过与适合的丁醇分离方法相耦合，及时将丁醇分离出来使丁醇产量增加。

5 展望

使用非粮生物质原料发酵产第二代生物燃料丁醇是未来能源工业的发展方向，但真正的用于工业生产还需解决一些问题，如产量低和生产成本高的问题，综合上综述可以从以下几个方面加以解决①使用价格便宜的农作物秸秆、富含糖质的植物或废液等，从而降低生产成本。②高产或高耐受丁醇菌株的筛选和构建，以提高产物浓度。③采用适宜的丁醇分离方法，从而解除产物的抑制，还可将丁醇富集，降低下游回收提纯的成本。④使用丁醇新工艺，可以节约预处理成本，避免资源浪费等。我国是一个农业大国，每年的农作物秸秆产量巨大，大部分都通过焚烧处理掉，既浪费资源又污染环境，如果能通过发酵法生产生物燃料，我国将有效的摆脱能源危机和粮食危机。

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[51]林逸君，闻志强，朱力，等.Clostridiumthermocellum与Clostridium beijerinckii偶联发酵玉米棒芯产丁醇[J].高校化学工程学报，2013，27（3）：444-449.

《中国酿造》杂志广告征订启事

《中国酿造》创刊于1982年，是由中国商业联合会主管，中国调味品协会及北京食品科学研究院主办的综合性科技月刊（国内统一刊号CN 11-1818/TS，国际标准刊号ISSN 0254-5071，广告许可证号：京宣工商广字第0033号）。全国各地邮局均可订阅，邮发代号：2-124；国外总发行：中国国际图书贸易总公司，国外发行代号：BM1437。《中国酿造》历次被评为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、《中国知网》重点收录期刊、《万方数据库》全文收录期刊、《中文科技期刊数据库》来源期刊、中国学术期刊网络出版总库收录期刊、美国《乌利希期刊指南》（UPD）收录期刊、英国《食品科学文摘》（FSTA）收录期刊、英国《国际农业与生物科学研究中心》（CABI）收录期刊、美国《化学文摘》（CA）收录期刊、俄罗斯《文摘杂志》（AJ）收录期刊、中国科学评价研究中心（RCCSE）数据库收录期刊，也是学位与研究生教育的中文重要期刊。

《中国酿造》重点报道调味品、酿酒、食品微生物、食品添加剂、发酵乳制品、生物工程技术、生物化工、生物质能源的开发利用等研究方向的新工艺、新技术、新设备、分析检测、安全法律法规及标准、保鲜与贮运技术、综合利用、质量保障体系等方面的基础理论、应用研究及综述文章。设有“研究报告”、“专论综述”、“创新借鉴”、“经验交流”、“分析检测”、“产品开发”、“酿造文化”、“海外文摘”等栏目。

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《中国酿造》杂志社

Research progress of butanol fermentation production

WANG Hong1,LUO Huibo1,2*,LIAO Yuqin1,DENG Lu1,LIU Lin1,LI Fen1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China)

In recent years,the international market oil price is greatly rising and supply is not stable.Meanwhile,the environmental pollution problem is increasingly prominent.Using renewable raw materials to produce butanol by fermentation is attracting widespread attention.Butanol,as a kind of clean and sustainable fuel used in the energy industry,has good potential and prospect.At present,the cost for butanol production is high,mainly in high raw material cost and low product concentration.The paper reviewed the research status of fermentation technology for butanol production from four aspects:selection of non-food biomass,breeding or constructing new strains with high butanol production,separation of butanol and selection of suitable new technology,which aims at providing reference for reducing the cost of production and promoting the development of butanol industry.

butanol;fermentation;strains;feedstock;technology

TQ923

0254-5071（2017）04-0010-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.003

2017-02-07

四川理工学院研究生创新基金项目（y2016003）

王洪（1991-），男，硕士研究生，研究方向为酿酒生物技术及应用。

*通讯作者：罗惠波（1969-），男，教授，硕士，研究方向为酿酒生物技术及应用。