室内混合藻种荒漠藻结皮培养条件优化研究

景丽百合，刘左军，徐 文，杨利云，蓝雯琳(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730050)

室内混合藻种荒漠藻结皮培养条件优化研究

景丽百合，刘左军，徐 文，杨利云，蓝雯琳

(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730050)

荒漠；藻结皮；土壤水分；具鞘微鞘藻；爪哇伪枝藻

为了探索促进荒漠藻结皮形成的最优条件，以民勤地区优势藻具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻为材料，通过室内控制试验，研究了混合藻比例、土壤含水量和接种量对藻结皮培植与发育的影响。结果表明：混合藻种荒漠藻结皮中藻类生物量随接种量和土壤含水量的增加而增加，一定比例的爪哇伪枝藻可显著地促进藻类生物量的积累；混合藻种荒漠藻结皮中藻类生物量积累的最优条件是混合藻比例为8∶2(具鞘微鞘藻∶爪哇伪枝藻)、土壤含水量为10%、接种量为10 μg/cm2(以叶绿素a含量计)。

1 研究背景

土地荒漠化是当前全球性的重要环境问题之一。我国荒漠化土地面积约占国土陆地面积的1/3，严重影响了农牧业生产和生态环境的可持续发展[1-2]。荒漠藻类作为先锋拓殖植物，能够在干旱、营养匮乏、高温、大风、强紫外线辐射等极端恶劣环境下生长、繁殖，通过自身的活动影响并改变环境，具有极为重要且不可替代的生态学意义[3-5]。土壤结皮是指土壤表面由苔藓、地衣、藻类、细菌等生物组分与其下很薄的土壤共同形成的一个复合的生物土壤层。在广大的干旱沙漠地区，随着流动沙丘的逐步固定，地表常伴随出现大量的结皮层，这些结皮层有效地阻止了流沙的移动，同时也对以后的植被演替进程起到了积极的作用[6-9]。这种结皮可与表层土壤牢固地结合在一起，其主要组成部分是荒漠藻，特别是蓝藻[10]。大量报道表明，泌糖丝状蓝藻是这些生物结皮中的优势种[11]，其中微鞘藻属(Microcoleus)和伪枝藻属(Scytonema)无论在垂直分布还是在生态分布上都很广泛。具鞘微鞘藻(M.vaginatusGom.)和爪哇伪枝藻(S.javanicumBornetFlah)是生物结皮的先锋拓殖优势物种，对于生物结皮的形成和发育具有十分重要的作用。

尽管荒漠藻是荒漠生境的先锋拓殖植物，但是沙丘表面自然藻结皮的形成需要若干年才能完成。为了在流沙表面快速形成藻结皮来治理荒漠化，需要人为地接入适量的荒漠藻[5]。影响藻结皮形成、发育的因素有很多，包括种类组成及其比例、生物量、有机质、土壤理化性质及气候等[12]。在以往的研究中通常是以单一优势藻种为试验材料，对于具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻这两种优势藻的不同比例构成对藻结皮形成和藻类生物量积累的影响并没有深入研究。本研究利用从民勤荒漠藻结皮中纯化、分离的这两种主要的优势藻类，通过实验室模拟自然生境试验，对混合藻比例构成、土壤含水量和接种量3个因素进行优化，旨在在最优条件下让活体藻在流沙上迅速进行生物量的积累和荒漠藻结皮的形成，为下一步将藻类广泛应用于荒漠地区植被的恢复与重建过程提供理论依据和试验数据，这对于接种荒漠藻固沙技术的应用具有积极的意义。

2 研究材料与方法

2.1 样区概况

甘肃省民勤综合治沙试验站研究区位于甘肃河西走廊东北侧，石羊河下游，地处腾格里沙漠西缘，地理位置101°59′～104°12′E、38°08′～39°26′N[13]，属于典型的干旱荒漠气候。年均气温7.7 ℃，极端最高气温41.0 ℃(1999年7月22日)，极端最低气温-30.8 ℃(1991年12月27日)，1960—2005年年平均降水量115.9 mm，年潜在蒸发量2 452.7 mm，干燥度5.85。年平均风速为2.4 m/s，多年平均风速≥17 m/s的大风日数为27.4 d，沙尘暴日数37.1 d。土壤为风沙土，pH值为7.8～8.5。试验样地周围地势平坦，流动沙丘、固定沙丘、半固定沙丘等为主要的地貌类型。

2.2 研究材料

研究中荒漠藻结皮土样(2015年4月)采自民勤综合治沙试验站研究区治理3年的固定沙丘(102°58′29.04″E，38°36′34.44″N)表层(0～2 cm)。土样经研磨、过筛(孔径0.25 mm)后，称取10 g放在盛有150 mL的BG11液体培养基的250 mL三角瓶中(已灭菌)，震荡24 h，制得均匀的土悬液，然后置于温度(25±5)℃、光照度1 000～2 000 lx、光周期为16 h/8 h(光/暗)的光照培养架上进行培养。待培养20 d后，将生长出的藻类用小镊子夹出制片，在数码显微镜下观察，并将各种藻类进行分离、纯化。将纯化后的具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻分别采用BG11培养基与BG110培养基在室温下通气扩大培养，为后续试验提供充足藻种。

2.3 人工荒漠藻结皮的培养

先将土样(采自民勤综合治沙试验站研究区治理3年的固定沙丘)平铺(厚度<1 cm)在烘箱中，调节温度为(95±5)℃，烘4 h以上，再将灭菌后的土样冷却，分装在16 cm×10 cm的塑料盒中(每盒0.8 kg土)，然后在无菌条件下将具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻的藻培养物以不同比例(按鲜质量计)充分混匀，最后将不同比例的混合藻种均匀地喷洒在塑料盒中的土样表面。每个处理均设5个平行。将接种后的塑料盒置于(25±5)℃、1 000～2 000 lx、光周期16 h/8 h(光/暗)的光照培养架上进行结皮培养。培养期间，于每天上午9：00将接种过的塑料盒放在天平上，使用微喷补足试验需水量。自接种后每隔7 d补充一次BG11营养液(方法同补水一致)，补充营养液当天不再补水。

2.4 不同因子的梯度设置

在实验室模拟生境中，主要的生态因子有温度、光照、水分、接种量、混合藻比例和土壤类型等。本试验选取混合藻比例、土壤含水量、接种量3个因子研究其对人工荒漠藻结皮形成的影响。混合藻种的搭配比例(具鞘微鞘藻∶爪哇伪枝藻，按鲜质量计)为10∶0(CK)、9∶1、8∶2、7∶3；土壤含水量设为0(CK)、5%、10%、15%、20%；接种量(以叶绿素a含量计)设为0(CK)、5、10、20、40 μg/cm2。在研究每个因子时，均固定其他因子，每个因子重复5次。

2.5 结皮采样与试验指标的测定

从各因子试验的当天开始，每隔2 d采集正方形结皮小块4 cm2，小心去除结皮底层过多的沙粒，将结皮样品放入预先准备好的离心管中，加入95%乙醇5 mL震荡，在室温暗环境放置并过夜，8 000 rpm/min离心5 min，取上清，定容至10 mL，于波长665、649 nm处测量吸光度值OD665、OD649，然后计算1 cm2的结皮样品所含叶绿素a的含量(μg/cm2)，公式为

叶绿素a含量

试验数据的统计分析利用SPSS 16.0软件进行，采用Duncan法进行差异显著性多重比较。利用Excel 2003进行数据计算和图形制作。

3 结果与分析

3.1 混合藻不同比例构成对荒漠藻结皮中藻类生物量的影响

由图1和观测可知，接种后3 d，荒漠藻结皮中藻类生物量迅速下降；接种后6 d，藻类生物量开始增加，且混合藻比例为7∶3、8∶2和9∶1的处理组形成肉眼可见结皮；接种后9 d，荒漠藻生物量迅速增长，出现第一个峰值，各处理组均形成肉眼可见结皮；在接种后21 d出现第二个峰值，藻体整体生物量有明显增加，结皮增厚，荒漠藻生物量的积累随时间的推移呈现递增的趋势，并逐渐趋于稳定；在接种后30 d藻体生物量有所下降。用SPSS 16.0软件对藻类生物量进行差异显著性分析发现，接种后3～6 d的藻类生物量与21 d之后的藻类生物量水平均有显著差异(P<0.05)。这表明，在接种后荒漠藻对新环境不能迅速适应，表现为部分藻体死亡；接种6 d后，藻类逐渐适应了新的环境，并开始增殖，且一定比例的爪哇伪枝藻可以加快荒漠藻结皮的形成速度；9 d后，随着藻体基数的增大，藻体进入对数生长期而迅速增长，21 d后，藻体的整体生物量水平已基本稳定；接种后30 d，藻类经过一段时间的生长后，部分藻体衰亡，致使荒漠藻结皮中藻类生物量下降。

图1 不同混合藻比例处理下荒漠藻生物量的变化

注：初始接种量为10 μg/cm2，土样含水量为10%，不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上差异显著。

对不同处理下的荒漠藻生物量进行方差检验[14]，结果表明，不同混合藻比例处理对荒漠藻结皮的藻类生物量影响显著(F=6.757，P<0.05)。由测定结果和图1可知，荒漠藻生物量最小值(2.382±0.19)μg/cm2出现在接种后3 d的CK处理组，最大值(14.648±0.31)μg/cm2出现在接种后21 d的8∶2处理组。由表1可知，8∶2处理组与7∶3、10∶0处理组的藻类生物量有显著差异，但与9∶1处理组无显著差异,各处理组荒漠藻生物量的大小关系为8∶2>9∶1>7∶3>10∶0。这说明，与单一藻种相比，一定比例的爪哇伪枝藻能够促进荒漠藻结皮中藻类生物量的积累和荒漠藻结皮的快速形成，具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻比例为8∶2时最有利于荒漠藻结皮的形成和藻类生物量的积累。

表1 不同混合藻比例对荒漠藻生物量的影响

3.2 土壤含水量对混合藻种荒漠藻结皮中藻生物量的影响

由图2和观测可知，荒漠藻生物量随土壤含水量的增加而增加，且荒漠藻生物量的积累随时间的推移呈现递增的趋势。在接种9 d后，不同土壤含水量处理组均形成肉眼可见结皮，18 d后，混合藻种荒漠藻结皮厚度明显增加，且藻体整体的生物量水平逐渐趋于稳定。

图2 不同土壤含水量对荒漠藻生物量的影响

注：初始接种量为10 μg/cm2，具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻比例为8∶2，不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上差异显著。

方差检验结果表明，不同土壤含水量对混合藻种荒漠藻结皮中藻类生物量影响显著(F=9.787，P<0.05)。由测定结果和图2可知，藻类生物量最小值(1.039±0.17)μg/cm2出现在接种后15 d的CK处理组，最大值(25.942±0.24)μg/cm2出现在接种后24 d的15%处理组。由表2可知,土壤含水量10%、15%与20%处理组的藻类生物量显著高于CK与5%处理组，土壤含水量5%、10%、15%、20%处理组的藻类生物量显著高于CK处理组，土壤含水量15%处理组的藻类生物量最高，但与10%、20%处理组差异不显著。这说明，在混合藻种荒漠藻结皮形成过程中，藻类生物量随土壤含水量增高而增大，且高于10%时能够显著地增加荒漠藻的生物量，考虑到荒漠地区水分供给量不足，故10%为最适土壤含水量。

表2 不同含水量对混合藻种荒漠藻结皮中生物量的影响

3.3 混合藻种接种量对荒漠藻结皮中藻类生物量的影响

由图3和观测可知，混合藻种荒漠藻结皮中藻类生物量随接种量的增加而增加，且藻类生物量的积累随时间的推移呈现递增的趋势。接种后9 d，荒漠藻生物量迅速增长，出现第一个峰值，且接种量为10、20和40 μg/cm2的处理组均形成肉眼可见结皮；在接种后18 d出现第二个峰值，接种后24、27 d藻体整体的生物量水平逐渐趋于稳定，接种后30 d藻体生物量有所下降。

图3 不同接种量处理对荒漠藻生物量的影响

注:土样含水量为10%，具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻比例为8∶2，不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

方差检验结果表明，不同接种量处理对荒漠藻结皮的藻类生物量影响显著(F=3.092，P<0.05)。由表3可知，A(CK)与B、C、D及E处理间均有显著差异，B与D、E处理间也存在显著差异， 各处理组荒漠藻生物量的大小为E>D>C>B>A(CK)。由测定结果和图3可知，荒漠藻生物量最大值(28.37±0.23)μg/cm2出现在接种后27 d的E处理组，最小值(0.75±0.047)μg/cm2出现在接种后3 d的A(CK)处理组。 这说明， 人工增施荒漠藻有利于其生物量的迅速积累，且荒漠藻生物量随接种量增大而增大。当初始接种量为10 μg/cm2以上时各处理下荒漠藻生物量无显著差异，并在接种一周后形成肉眼可见的荒漠藻结皮。接种量为20和40 μg/cm2处理下藻类生物量均值均低于初始接种量，故最适初始接种量为10 μg/cm2。

表3 混合藻种不同接种量处理对荒漠藻类生物量的影响

4 讨 论

4.1 混合藻比例构成对荒漠藻结皮形成的影响

藻类的组成及其比例是影响藻结皮形成和发育的重要因素之一。郑云普等[12]认为，接入的具鞘微鞘藻中添加适当比例的其他藻类(如眼点伪枝藻、席藻、念珠藻和绿藻等)，能够产生互惠互利的生态效应，在一定程度上能增加具鞘微鞘藻的生长、繁殖速度。本研究通过对混合藻种的研究发现，在其他因子均固定时，样品中的藻类生物量基本上随着具鞘微鞘藻比例的升高而增加，但仅采用具鞘微鞘藻接种时藻类生物量反而减少，一定比例的爪哇伪枝藻能够加快荒漠藻结皮的形成速度，当具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻比例为8∶2时，藻类生物量的积累量达最高。这是因为，具鞘微鞘藻是一种常与其他藻类混生的物种[15]，它们之间可能存在着某种共生关系[16]。在接种的具鞘微鞘藻中加入适当比例的爪哇伪枝藻，能够促进藻类增殖和藻结皮的形成，但其相互作用及混合藻种荒漠藻结皮的胶结机理还有待于今后进一步深入研究。

4.2 土壤含水量对混合藻种荒漠藻结皮形成的影响

干旱或水分的极度短缺是荒漠地区最为显著的生态环境特征,也是限制沙漠生物生长的重要因子。本研究结果表明，在裸沙表面含水量很低时(<5%)，不能有效地形成藻类结皮，藻类生物量也很低；随着土壤湿度的增加，藻类生物量显著增加，当土壤含水量大于10%时，荒漠藻量显著增加。这与黄文福、张丙昌等[17-18]对单一藻种的研究结果是一致的。但当土壤含水量大于5%时，混合藻种在裸沙表面形成肉眼可见结皮，这不同于黄文福等[17]对单一藻种的研究结果，原因是：爪哇伪枝藻对干旱的适应机理在细胞形态结构方面表现为，细胞和藻丝常以聚集、成堆的方式存在，细胞外有黏胶层、胶鞘和较厚的细胞壁，胶被中蛋白质、多糖和孢粉素等物质呈精致的排列[19]，且细胞整体结构高度稳定，细胞结构中具发色团和折射颗粒等[20]，与具鞘微鞘藻相比爪哇伪枝藻在干旱胁迫下具有更强的抗逆性。因此，在土壤含水量很低的条件下，混合藻种相比于单一藻种更容易形成荒漠藻结皮。

4.3 混合藻种接种量对荒漠藻结皮形成的影响

当裸沙表面的藻类生物量达到一定数量的时候，才能形成肉眼可见的藻类结皮，藻类生物量的积累随接种量的增加而明显增加。郑云普、黄文福、谢作明等对单一藻种在荒漠藻结皮形成过程中的作用[12]、不同培养条件对单一藻种荒漠藻结皮形成[17]及对其生物量的影响[21]做过大量研究。本研究以混合藻为试验对象，深入研究了不同因子对混合藻种荒漠藻结皮的形成和藻类生物量的影响，结果表明：裸沙表面不人为接种藻类时，不形成荒漠结皮，并且藻类生物量极低，当接种量大于10 μg/cm2时，接种一周后形成肉眼可见的结皮，且藻类生物量积累迅速。这与文献[12,17]的研究结果是基本一致的。但当混合藻种接种量大于20 μg/cm2时，随着接种量的增加，藻类生物量的积累速率下降。分析其原因可能是：①随着藻体密度的增加，藻体之间相互遮挡光源的可能性加大，能够照射到细胞的有效光强下降，藻细胞的光合作用降低，从而导致藻体生物量增殖速率下降[21]；②初期裸沙表面营养成分低，不足以提供大量藻体生长所必需的营养物质，随着藻体的生长，营养成分逐渐耗尽，便抑制了藻体的增殖，部分藻体死亡，使得藻体生物量的积累速率下降，藻体整体生物量趋于稳定；③具鞘微鞘藻与爪哇伪枝藻在藻体密度较小时生长相互促进，在藻体密度较大时，生长过程中由于空间和营养物质的限制，可能会发生竞争或产生某种物质抑制对方的生长，具体机理还有待于深入研究。

5 结 论

本研究情况下，促进混合藻种荒漠结皮形成的有利条件是：①接种量为10 μg/cm2(以叶绿素a含量计)；②土壤含水量为10%；③混合藻比例构成为8∶2(具鞘微鞘藻∶爪哇伪枝藻)。

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(责任编辑 徐素霞)

甘肃省科技支撑计划项目(1011FKCA108)；中国石油天然气股份有限公司科学研究与技术开发项目(2014D-4610-0501)

S154.3；S288

A

1000-0941(2017)01-0041-05

景丽百合(1991—)，女，甘肃酒泉市人，硕士研究生，主要从事环境修复方面的研究；通信作者刘左军(1957—)，男，陕西三原县人，教授，博士，主要从事生态工程方面的研究。

2015-12-17