羊痘的诊断与疫苗研究进展

李 杨，颜新敏，吴国华，李 健，叶奕优，赵志荀，朱海霞，张志东，张 强

(1．中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046; 2．深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045)

羊痘的诊断与疫苗研究进展

李 杨1，颜新敏1，吴国华1，李 健1，叶奕优2，赵志荀1，朱海霞1，张志东1，张 强1

(1．中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046; 2．深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045)

羊痘病毒粒子大小约为150 Kbp，分子量约为73～91 MDa。该病毒能引起羊的急性、热性、接触性传染病，因其病毒结构及其发病症状和人类的天花很像，又称“羊天花”。根据分离的毒株不同，羊群的发病率为75%～100%，死亡率在10%～58%。目前没有特效治疗药，只有通过实验室诊断和免疫预防来减少疾病的发生。

1 血清学诊断

琼脂免疫扩散试验(AGPT): 早在1963年Bhalnbani和krish就应用同源或异源血清通过琼脂扩散试验对羊痘病进行诊断［1］，但是存在羊痘和传染性脓疱性皮炎(CPD)的抗原交叉反应。1986年对常规的AGPT做了改进，采用S35蛋氨酸标记抗原，提高了检测的灵敏度。

对流免疫电泳(CIEP): 1985年建立了对流免疫电泳快速诊断绵羊痘的方法，CIEP在检测感染组织和细胞中的特异性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等［2］设计电泳时用巴比妥缓冲液代替普通的盐溶液极大地提高了CIEP的敏感性。

荧光抗体技术(FAT): 1986年Soman等通过FAT对感染羊肾细胞和睾丸细胞的羊痘病毒抗原进行检测［3］。此方法快速简单，在抗原感染14～24 h之间就能被检测到。也能够检测到感染动物水疱疮液、皮肤、LK和LT细胞中的羊痘病毒抗原。

血凝试验(Hemagglutination Test，HT): 羊痘病毒因对动物红细胞不产生凝集作用，用致敏的绵羊红细胞来进行血凝试验。1989年，Joshi等通过将羊痘抗体连接到葡萄球菌A蛋白(SPA)上，成功的建立了检测羊痘的协同凝集试验。2005年，王开功等［4］采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝试验，对山羊痘病毒抗原具有特异性和敏感性，对疫区采集的山羊痘待检抗原的检测结果表明，反向间接血凝法的敏感性比琼脂免疫扩散试验高。

酶联免疫吸附试验(ELISA): ELISA是抗原抗体反应与酶促反应相结合的一种技术，因其快速、便利、特异性强等特点被应用于羊痘病的诊断。1988年，Sharma等［5］首次将ELISA用于山羊痘病毒的检测，通过用活的和灭活的抗原与高免血清检测山羊痘的血清与抗体，但是实验背景高，且假阳性结果较高。随后应用皮肤活检建立了免疫捕获ELISA，该方法特异性能达到80%～100%，敏感性能达到70%～86%。1998年，建立了检测山羊痘病毒的dot-ELISA检测方法，通过dot-ELISA和CIEP两种方法对西孟加拉的38个疑似羊痘病毒感染的样品进行检测，结果显示dot-ELISA方法能检出28份阳性，检出率为68.4%，而CIEP能检出21份阳性，检出率为55.3%。用已知的阳性样品作对照，dot-ELISA显示100%的相关性，CIEP只有80%。dot-ELISA有较高的敏感性和特异性，并能用于野外诊断。2008年吴国华等［6］建立了羊痘病毒双抗体夹心ELISA检测方法，用该方法检测羊传染性脓疱病毒和口蹄疫病毒，显示无交叉反应，具有较高的特异性，与琼脂扩散试验对比，其敏感性高4～8倍，可用于对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测。

2 分子生物学诊断

基于临床症状和血清学的诊断并不总是可靠的，所以为了克服这些限制，简单、快速、特异地PCR技术成为检测羊痘病毒并区分LSDV的有效手段。根据羊痘病毒的衣壳蛋白P32基因序列设计了相应的引物，分别建立了检测羊痘的PCR方法，成功的从样品中扩增出目的条带。Markoulatos针对SPPV的ITR和α微管蛋白基因设计2对引物，建立了用于检测皮肤组织中SPPV的多重PCR技术，该方法敏感性和特异性较好，24 h内就可作出检测，但偶尔会出现假阴性结果。Hosamani根据山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因序列的差异，建立了区分GTPV和SPPV的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)。2010年，Lamien根据G蛋白偶联趋化因子受体基因建立了q-PCR方法，该方法使用双杂交探针，根据荧光溶解曲线，可以种属鉴别及基因分型。2008年，韩若婵等［7］根据P32基因和末端反向重复序列基因片段设2对引物，建立多重PCR检测方法，用此方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒，结果均为阴性。2014年，赵志荀等［8］基于羊痘病毒的保守序列ITR设计三套引物，建立了区分绵羊痘和山羊痘的环介导等温扩增技术(LAMP)，并对48份绵羊痘感染样品和87份山羊痘感染样品进行检测，检出率分别为100%和98.8%。

3 疫苗及免疫

3.1 血清接种 用发病并恢复健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接种羊，但是，其温和的保护和血清免疫的失败、致敏淋巴细胞，使之不能作为长期有效的免疫方法。

3.2 弱毒疫苗 1957年，我国袁庆志等［9］等通过将绵羊痘病毒在绵羊与鸡胚之间交替传代，使病毒毒力减弱，并保持了良好的免疫原性。目前我国使用最多的仍然是沈荣显分离的山羊痘病毒太原株经鸡胚减毒后的弱毒疫苗，命名为AV41疫苗株，该疫苗免疫动物后免疫持续期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗绵羊痘病毒感染。印度研制的经Vero细胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接种102.5 TCID50的剂量，能提供4～6月龄的山羊52个月的保护［10］。肯尼亚绵羊山羊0240株是在自然条件下，同一个属的病毒出现重组并分离得到的，此疫苗株能够很好保护绵羊和山羊，在非洲的一些国家用于绵羊和山羊的接种免疫。但是弱毒疫苗存在免疫动物后毒力返强和散毒的风险，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。

3.3 多肽疫苗 绵羊痘病毒的VP3蛋白被证明是免疫性蛋白，并且在兔体内能引起高水平的体液免疫和细胞免疫［11］。用弗氏不完全佐剂乳化的VP3蛋白免疫羊可诱导产生1∶256滴度的血清抗体，对免疫 VP3后接种病毒21 d的羊提供67%的保护［12］。羊痘病毒的另一种结构蛋白－P32蛋白，是近些年的研究热点，它有很好的免疫原性，能够诱导中和抗体的产生，但是由于P32蛋白表达量低并且不稳定，这在一定程度上制约着此方法的应用前景。因此，找到另一种免疫原性更好，表达量、稳定性更好的基因势在必行。

3.4 活载体疫苗 随着分子技术的发展，以羊痘病毒作为活载体的研究取得了一些进展。羊痘病毒作为活载体有很多优点，其基因组结构明确，稳定性强，基因组容量大，可容纳至少25 Kb的外源基因而不失去感染力，有多个复制非必需区，对外源基因的插入耐受性强。羊痘病毒宿主范围窄，只感染羊，对其他动物安全性高，并且能引起强烈的细胞免疫。Romero等［13］构建的牛瘟病毒H基因的重组山羊痘病毒，动物试验显示，体内存在滴度较高的山羊痘病毒中和抗体和牛瘟病毒中和抗体。另外，Wade-Evans等［14］构建表达了蓝舌病VP7基因的重组羊痘病毒。Aspdcn等［15］构建表达狂犬病病毒糖蛋白的重组羊痘病毒，作为复制缺陷型疫苗。Berhe等［16］构建表达小反刍兽疫病毒F基因的重组羊痘病毒都有很好的效果。

4 讨论

目前我国研究羊痘病毒的实验室已经研发出多个可以用于羊痘病毒诊断的分子和血清学诊断方法，但是各种原因，目前国内尚没有商品化的诊断试剂盒问世，所以推动羊痘病毒诊断的标准化势在必行。

随着分子生物学的迅猛发展，目前对羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范围基因和宿主之间的关系等基础研究的深入，为研发新的检测方法和疫苗提供了依据。另外，羊痘病毒作为活病毒载体有着众多优点，研发羊痘病毒活载体为基础的多价疫苗是今后一个重要的研究方向。

由于羊痘目前仅在亚洲和非洲发展中国家和落后国家大规模流行，欧洲早已消灭了羊痘病毒，因此发达国家对羊痘的研究较少。羊痘病毒的免疫和致病机制的研究几乎是空白，因此，要加强和推动羊痘病毒的基础研究，为羊痘的诊断、疫苗的研发和疾病的控制奠定基础。

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S852.65+4

A

0529-6005(2017)06-0086-03

2016-07-19

国家重点研发计划课题(2016YFD0500907);甘肃省国际科技合作专项(1604WKCA012);甘肃省国际科技合作专项(1504WKCA055)

李杨(1990-)，男，硕士生，研究方向为分子免疫与环境控制，E-mail:843290952@qq．com

颜新敏，E-mail:qzhang1616@sohu．com;张强，E-mail: qzhang1616@sohu．com