蛋白质定向进化技术概述

王松明，顾招兵，朱雅新，冷静，冯励，李清，杨舒黎*

（1.云南农业大学动物营养与饲料科学重点实验室，云南昆明650201；2.中国科学院微生物研究所，北京朝阳100101）

蛋白质定向进化技术概述

王松明1，顾招兵1，朱雅新2，冷静1，冯励1，李清1，杨舒黎1*

（1.云南农业大学动物营养与饲料科学重点实验室，云南昆明650201；2.中国科学院微生物研究所，北京朝阳100101）

定向进化技术是近二十年发展起来的蛋白质改造技术，其可通过对基因的突变和重组来构建突变库，然后通过高通量的筛选鉴定性能改善的突变体，此技术是改善酶性能最有效的途径之一。本文就定向进化技术的几种常用方法和定向进化后的文库筛选、应用及展望进行了概述。

定向进化；易错PCR；DNA改组；定向筛选

1967年Spiegelman等提出在分子水平上体外定向进化生物分子的思想，当时他们定向进化的对象是RNA（Spiegelman等，1969、1967）。定向进化属于蛋白质的非合理设计范畴，其不需要事先了解蛋白质空间结构和构效关系，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，从而在较短时间内定向选择出所需性质或功能的基因。定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平的应用和延伸。

1 定向进化方法

目前常用的定向进化技术有易错PCR（Chen等，1991）、DNA改组（Stemmer等，1994）、交错延伸（Zhao等，1998；Stemmer等，1994）、体外随机引发重组（Shao等，1998）、渐增切割法产生杂和酶（Ostermeier等，1999）、酵母增强组合文库（Abecassis等，2000）、过渡模板随机嵌合生长技术（Coco等，2001）、不依赖序列同源性的蛋白质重组（Sieber等，2001）等。定向进化技术已被用于许多酶性能的改善。

1.1 易错PCR易错PCR（ep-PCR）原理是在体外扩增基因时使用适当的条件，使扩增的基因出现少量碱基误配而引起突变。如增加Mg2+浓度，使用低保真度的Taq酶，改变反应体系中4种dN TP的浓度，加入Mn2+，采用突变酶等。也可以改变多个条件，增大碱基误配的机率。易错PCR只能使原始蛋白质中很小的序列空间发生突变，因而一般适用于较小的基因片段（<2000 bp）。但对于初涉定向进化的研究者，易错PCR不失为一种有效、实用的进化方法。另外，迭代易错PCR可使小的有益突变累积而产生大的提高（You等，1996；Reuben等，1969）。Chen等（1993）用易错PCR定向进化枯草杆菌蛋白酶，所得的突变体在60%和85%的二甲基甲酞胺中，催化效率Kca/Km分别是野生酶的256和131倍，比活性提高了157倍。

1.2 DNA改组DNA改组（DNA shuffling）是用重组的方法将两种以上同源正突变基因序列（或天然存在的基因家族）重新排布而引起基因突变的进化技术，由Stemmer等（1994）首次提出并成功运用。该法是对某一目的序列进行DNaseⅠ随机片段化，然后对这些短片段进行组装和基因重组，最后对这些组装和基因重组的片段进行筛选，筛选有意义和达到目的的正向重组子，对于一轮重组的结果不好时可以重复多次进行DNA改组。当DNA改组用来重组一套进化上相关的基因时，又被称为家族改组，如改组4种头孢菌素酶基因，酶活增加了270～540倍，而单基因改组只增加了8倍（Crameri等，1994）。对于易错PCR，DNA改组技术可以说是一次成功的飞跃，能将两个或多个父本基因的优良性状加以组合，从而构建出更多样性的突变文库，在实际应用中常与易错PCR技术结合使用。

1.3 交错延伸重组基于DNA改组的原理提出了交错延伸（StEP）重组技术，其是一种简化的DNA改组技术。与DNA改组不同的是，其将含不同点突变的模板混合进行PCR反应，同时将常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，随之进行多轮变性、短暂复性/延伸反应，此过程反复进行直至获得全长基因。重组的程度可以通过调整反应时间和温度来控制。在每一轮PCR循环中，部分延伸的片段可以随机杂交到含有不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组。Zhao等（1998）利用迭代易错PCR获得随机点突变，并用交错延伸方法重组DNA，采用连续提高培养温度对突变体进行筛选最终获得一株突变体，在酶的功能未发生任何变化的前提下，不仅将该酶的最适温度提高了17℃，还使酶在65℃的半衰期延长了200倍。

1.4 体外随机引发重组基于DNA改组的原理，提出了体外随机引发重组（RPR）技术。其是用一套随机序列引物，产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段库（由于碱基的错配，这些短DNA片段也含有少量的点突变）。然后进行类似于DNA改组的全长基因装配反应，获得多样性文库。与DNA改组相比，RPR具有以下优点：（1）可用单链DNA或mRNA为模板。（2）模板量要求少，大大降低了亲本组分，筛选便利。（3）随机片段不是由亲本基因切割获得，大大降低了亲本DNA的制备量。（4）克服了DNA改组中DNaseⅠ所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性。（5）片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作。（6）合成的随机引物具有同样长度，无序列倾向性。在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变。（7）随机引发合成的DNA不受模板DNA长度的限制。Shao等（1998）利用RPR方法成功地对枯草杆菌蛋白酶E进行了定向进化，经体外随机引发重组得到突变酶，其热稳定性比原始酶提高8倍。

1.5 渐增切割法产生杂和酶为了解决DNA改组介导的重组通常不能用于重组同源性低于70%～80%序列的问题（徐卉芳等，2002）。而自然界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。ITCHY的基本原理是控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度，间隔很短时间连续取样终止反应，从而获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将两组随机长度的5′端片段与3′端片段随机融合产生杂合基因文库。Lutz等（2001）在此基础上又提出了Thio-ITCHY方法，首先在同一载体上将待重组的两基因串联，然后在产物中通过PCR反应或单链模板引伸反应随机引入α-硫代磷酸核苷酸，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，切割反应会在随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库。ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在非序列同一区内产生活性融合子。迭代ITCHY或对其文库进行重组还可以创造多个交叉。

1.6 酵母增强组合文库酵母增强组合文库（CLERY）是一个真核基因家族改组策略。其原理是将体外DNA改组程序与酵母体内重组缔合起来，构建高丰度低亲本水平的重组文库。直接用含目的基因的质粒作为体外改组的模板；改组后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动体内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。Truan等（2000）用该法重组人细胞色素P450 1A1和1A2，所得文库含86%的嵌合基因，大大提高了文库丰度。

1.7 过渡模板随机嵌合生长技术过渡模板随机嵌合生长（RACHITT）技术（Coco等，2001）是与DNA改组概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术。其是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上，进行排序、修剪、空隙填补和连接的过程。过渡摸板是一条以一定间隔插入尿嘧啶的单链DNA分子，其中的悬垂切割步骤使短片段（比DNaseⅠ消化片段还短）得以重组，明显提高了重组频率和密度（刘卫晓等，2004）。Coco等（2001）利用RACHITT技术对二苯并噻吩单加氧酶进行改造，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比DNA改组类方法（1～4个交叉）高出几倍，并且可在短至5 bp的序列同一区内产生交叉，经筛选得到的突变酶不仅活力有所提高，酶的作用底物范围也得到明显拓宽。

1.8 不依赖序列同源性的蛋白质重组Sieber等（2001）提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（SHIPREC）方法，其可通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于其在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。迭代SHIPREC可以产生多个交叉。

综上所述，利用定向进化创建序列多样性文库的各种方法。都有其优缺点，但任何一种方法都不是万能的，在实际应用中，我们应该针对具体问题，选择合适的方法或方法组合，从而达到事半功倍的效果。

2 定向进化文库的筛选方法

酶或者蛋白质在进行定向进化后会产生定向进化文库，定向进化的关键在于进化后可从文库中筛选出想要的突变个体。在一个突变体库建好之后，选择一个灵敏、高通量、能用于目标筛选的方法，能否快速、准确的在庞大的突变体库中寻找出所需克隆是决定定向进化成败的关键。

定向进化技术表达体系的选择决定了筛选/选择的方式，定向进化技术表达体系的宿主基本分为两类：原核生物大肠杆菌（E.coli）和真核生物酵母（张达，2011）。E.coli易于生长和控制，操作方便、快捷、周期短。由于E.coli表达外源蛋白时容易形成包涵体，因此外源基因尤其是真核生物基因在E.coli中表达时，常常需要经过细胞破碎才能获得可溶蛋白。利用酵母作为宿主细胞时，通常选择的载体是能够在宿主内自主复制的酿酒酵母细胞。近年来，毕赤酵母作为宿主应用于酶的定向进化取得成功，利用毕赤酵母作为宿主的关键是构建能够在其体内表达的自主复制质粒载体。另外，除了大肠杆菌和酵母外，噬菌体表面展示技术（李丽芳等，2005；巨立中等，2003；Pedersen等，1998）、核糖体展示技术（Matsuura等，2003；Lamla等，2003）、荧光激活细胞分选（FACS）技术（Cohen等，2001）等也应用于定向进化中。

2.1 平板筛选平板筛选主要是依据细胞的表型，将含有随机突变基因的重组细胞从平板培养基上筛选出来。根据细胞表型的多样性，可以从多个方面筛选突变基因，例如逐步改变重组细胞生长的环境，依据细胞的耐受情况，可以筛选出一些对热、pH、抗生素等耐受性提高的突变酶；也可以将突变酶作用的底物加入平板培养基中，依据最终形成的透明圈的大小来筛选活力提高的酶，或者利用营养缺陷株作为宿主菌，根据菌株的生长情况对突变酶进行筛选；此外，通过颜色的变化排除无效重组细胞，也可以筛选高活力的突变酶（李珍华等，2013）。pH指示剂法常用于检测酯酶，以酚红为指示剂，随着酶催化酯类水解产生酸，通过体系中pH改变导致的颜色变化，就可以初步测定酶的活性（周琼等，2012）。

2.2 表面展示表面展示技术主要包括噬菌体表面展示技术、细菌细胞表面展示技术、酵母表面展示技术、核糖体表面展示技术等。基本原理是利用DNA重组技术，将目标蛋白质富集在噬菌体、细胞、核糖体等表面，其应用主要体现在筛选蛋白与蛋白间的相互作用（唐双焱等，2012）。

2.3 荧光筛选经典的荧光筛选大多是结合酶的荧光底物或产物，通过荧光强度的变化鉴定酶的活性。这种方法经常结合微孔板（如96孔或384孔）进行。荧光激活细胞分选（FACS）技术是将酶活性转化为可检测的荧光信号，并与酶所在的细胞构建联系，从而实现酶活性与细胞荧光强度的偶联。然后利用流式细胞仪监测荧光强度信号变化，并通过给目标细胞加上对应的电荷，对不同的酶进行分选收集（Cohen等，2001）。

3 定向进化技术的应用与展望

定向进化技术极大地促进了酶工程、代谢工程以及医药等很多领域的发展，在增强蛋白质的稳定性及底物特异性、改变或增强蛋白质的活性等方面都取得了巨大的成果。

Liu等（2001）利用易错PCR、DNA改组并结合高通量的筛选方法提高了D-泛解酸内酯水解酶的活力和稳定性，经过筛选获得突变株，其酶活力是野生型酶的10.5倍。张洪喜（2007）采用易错PCR技术、致突变菌株技术和使用双层平板检测法和液体酶活验证法对突变体库进行筛选，获得一株耐酸性突变体（Cel 18-7-12），最适pH为6.0。测序结果显示，纤维素酶第339位的氨基酸由Ile变为Thr，并且发生终止突变造成C-末端25个氨基酸的缺失。马安周（2008）利用易错PCR技术结合噬菌体展示系统进行了纤维素酶的定向进化。林凌（2009）采用易错PCR、DNA改组并结合平板筛选方法，得到了7株高活性突变株。其中内切葡聚糖酶突变体M44-11，S75和S78水解羧甲基纤维素钠的活性分别是野生型的2.03、2.54倍和2.68倍；此外，M44-11的酸碱耐受性和热稳定性也得到提高。Fujii等（2009）研究表明，对自养型假诺卡菌中VD3羟化酶通过随机突变引入氨基酸置换，可以增加底物结合部位或催化剂的其他相关区域的适应性，进而提高其VD3羟化酶活性，试验最终获得突变株的酶活比野生型菌株提高了6倍。Tao（2009）和Qin（2009）通过DNA改组的方法来提高链霉菌木聚糖酶B的热稳定性和耐碱性。最终获得的最佳突变株在70℃可稳定存在360 min，而野生型仅3 min就会损失50%的活性。另外，在pH 9.0的碱性缓冲液中的稳定性也有所提高。Mchunu等（2009）采用易错PCR来提高真菌木聚糖酶的碱耐受性，最佳突变株在pH 10、温度60℃的极端条件下存在90min后，仍能保持84%的活性，而野生型菌株在60min时只能保持22%的活性。王秀娟（2011）采用易错PCR方法，对工程菌WTCBHⅡ进行定向进化，得到了两株酶活力是出发菌株所产酶活力3倍的突变菌株CBHⅡX16和CBHⅡX305。对工程菌WTCBHⅠ进行定向进化，得到了两株酶活力是出发菌株所产酶活力2倍的突变菌株CBHⅠX88和CBHⅠX26。Liao等（2012）利用ep-PCR方法对植酸酶进行进化后，与出发菌相比，突变酶的比活力增强了61%，酶与底物亲和力增加了53%，催化效率提高了84%。Liu等（2012）为获得耐酸性的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（BLA），利用ep-PCR对BLA进行了定向进化，相比较野生菌株，三个突变株在pH 4.5条件下的Kcat/Km值分别提高了3.5、6.0倍和11.3倍，且突变株更耐受低pH条件，同时其热稳定性没有明显改变。黄奋飞（2012）通过易错PCR与DNA改组技术，对EGⅠCDS进行了随机突变，并构建了突变文库，进而对EGⅠ的热稳定性进行定向进化。得到了一个突变酶MutA19。其最适作用温度为65℃，较野生型提高了20℃。45℃时突变酶与野生酶均可保持活力的稳定；65℃时野生酶则迅速失去活力，而突变酶在60min内仍可保持活力的稳定。姜大磊（2012）采用DNA改组技术和平板筛选方法，得到了4株高活性突变酶。其中S1、S2、S3、S4的酶活力分别较野生型提高了5.75、4.78、3.19倍和3.61倍。张红（2013）应用易错PCR技术、细胞表面展示可控释放体系和平板筛选方法，对源于梭菌属的内切纤维素酶CpCel 5A和CpCel 9进行了定向进化。刘敏（2013）通过易错PCR技术对纤维素酶系进行改造。将定向改造后的CbhA突变体G10和CenA-BGL突变体A12-H1整合到质粒pET30a中，实现了整合得到的突变体降解纤维素酶，产生葡萄糖的比活（356.9 mU/mg）是野生型的2.7倍，其粗酶的相对活性（145.7 mU/ml）是野生型的8.2倍。曲莹（2015）采用易错PCR技术和细胞表面展示-释放系统对源于梭菌属的内切纤维素酶CpCel 5A进行了定向进化。利用96孔板高通量培养以及透明圈法来对构建的纤维素酶突变库进行筛选。得到了一个高活力纤维素酶5D4。聂简琪等（2016）采用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化，利用高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选，并获得了一株突变菌株4A4，其表达量提高了46.5%。梁艳莉（2016）应用易错PCR技术、表面展示释放系统和平板筛选方法，最终获得两株突变体3A11和5D4。与野生型相比，3A11对不溶性底物RAC的比活力提高了1.3倍，对可溶性底物CMC提高1.1倍。而5D4的酶活力分别对RAC和CMC降低了1.3、1.0倍。突变体3A11的最适pH值与野生型没有明显差异，均在5.0左右。

随着蛋白质定向进化技术的快速发展，其已经成为代谢工程与合成生物学不可或缺的工具，在人类健康、环境、能源等多个方面均具有重要的应用。除了发展先进的定向进化技术外，开发高突变效率的进化策略和易行通用的高通量筛选方法仍是未来蛋白质定向进化亟待解决的问题。我们深信随着这些定向进化方法的更广泛应用，以及更多、更有效的进化方法体系的建立，必将推动生命科学的诸多领域突飞猛进地向前发展，实现人类改造自然实践的一次又一次飞跃。

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Directed evolution method has been a kind of new technology of protein modification developed in recent 20 years，which build mutant library through the gene mutation and restructuring，and then identified the performance improvement of mutants with high-throughput screening methods.This was the effective way to improve enzyme properties. This paper reviewed the several frequently-used methods of directed evolution and library screening after directed evolution of protein.In addition，the application of recombination for directed evolution and prospection for the future of this technology also described.

directed evolution；error prone PCR；DNA shuffling；directed screening

S816

A

1004-3314（2017）14-0015-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171404

国家自然科学基金（31360562、31160467、30960256、31260543）

*通讯作者