沙柳PNY基因克隆、生物信息学及组织特异性表达1)

杨海峰 王文娟 刘乐 卜松雪 张雅喃 何丽君

(内蒙古农业大学，呼和浩特，010019)

沙柳PNY基因克隆、生物信息学及组织特异性表达1)

杨海峰 王文娟 刘乐 卜松雪 张雅喃 何丽君

(内蒙古农业大学，呼和浩特，010019)

为了促进沙柳(Salixpsammophila)分子定向育种，研究了其分枝及材性发育相关遗传机制。克隆获得了沙柳PNY基因。研究发现：沙柳PNY基因编码区全长1 446 bp，编码481个氨基酸残基。PNY蛋白由55.09%无规卷曲、29.73%α-螺旋及15.18%延伸链构成。保守结构域分析表明，该蛋白分子存在PNY蛋白典型的SKY、BELL、Homeodomain结构域。系统进化分析表明，沙柳与杞柳(Salixpurpurea)、毛果杨(Populustrichocarpa)的PNY基因亲缘关系最近。qRT-PCR组织特异性表达分析发现，PNY基因在沙柳腋芽部位表达量最高，茎、叶、顶芽、根中表达量依次降低。

沙柳；PNY基因；生物信息学；组织特异性表达

To promote the molecular breeding ofSalixpsammophila, we studied its branching and wood formation mechanism.PNYgene was cloned fromS.psammophila.PNYgene has 1 446 bp coding sequences which encodes a polypeptide of 481 amino acids, and this protein is consist of the 55.09% random coil, 29.73%α-helix and 15.18% extended strand. By the conserved domains analysis, there are conserved SKY, BELL and Homeodomain in PNY protein. By the phylogenetic analysis,PNYofS.psammophilahas closer relationship with those ofS.purpureaandP.trichocarpa. The results of qRT-PCR in different tissues ofS.psammophilashow that the highest level of thePNYexpression is in the leaf axil, and the expression levels are decreased successively in stem, leaves, apical buds and roots.

沙柳(Salixpsammophila)属于灌木或小乔木，能够抵御风沙，耐一定的盐碱，严寒与酷热的条件也可生存，繁殖比较容易，萌蘖力强，是固沙造林树种[1]。

同源异形盒基因广泛存在于真核生物中，在其生长发育中具有重要作用[2]。该类型基因结构包含一个约180个核苷酸高度保守的同源异形盒，可转录形成约60个氨基酸的同源异形结构域(HD)。该结构域两端含有亮氨酸拉链和一个酸性激活域，可与其他结构域形成异源二聚体，再与一个特殊靶序列相结合，即可调节特定基因。根据同源异形盒基因特点，将植物中具有同源结构域的蛋白分为7类，分别为ZM-HOX、HAT1、HAT2、ATHB8、GL2、KNAT、BELL[3]。其中KNAT和BELL的同源异型结构域由63个氨基酸组成，在第一、二个螺旋间插入了3个额外氨基酸残基(P-Y-P)，所以将植物中特有的KNAT(KNOTTED-like homeodomain)基因家族和BELL(BEL1-like homeodomain)基因家族归类为同源异形盒基因家族中的TALE(Three Amino-acid Loop Extension)亚家族[4-5]。

隶属BELL基因家族的PENNYWISE(PNY)基因有较多别名，如BEL1-LIKEHOMEODOMAIN9(BLH9)、BELLRINGER(BLR)、REPLUMLESS、VAAMANA等[6-11]。目前，PNY基因的研究主要利用草本模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)展开。研究发现，PNY参与的生物过程较复杂，涉及顶端分生组织、茎、花及果实等器官的分化发育[9-16]。例如PNY与KNOTTED1-like homeobox(KNOX)家族蛋白互作调节节间、顶端分生组织、花序及心皮的发育[9，11-12]，与POUND-FOOLISH(pnf)基因共同影响着拟南芥由营养生长向生殖生长的转化[13]，同时对成花基因GAMOUS(AG)、BOP等基因均有抑制作用[10]。研究发现，次生诱导后的拟南芥突变体pny的次生木质部更为发达[17]，这表明PNY基因在次生生长中也可能具有重要作用。因此，本研究由我国西部特有沙生灌木沙柳中克隆了PNY基因，对沙柳PNY基因进行生物信息学以及氨基酸序列结构的保守性分析，构建系统进化树及初步的组织特异性表达分析。本研究为木本植物中同源异形盒基因的研究提供了基础资料，同时也促进沙柳的分子育种研究，对培育枝条丛生型沙柳品系、增加土壤覆盖面积、防止水土流失及利用沙柳生物质能源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料

沙柳为2015年春季采自内蒙古达拉特旗国家沙柳无性系种质资源保存库的1年生枝条，实验室水培至20 cm。

1.2 方法

1.2.1 沙柳RNA的提取及cDNA合成

采用QIAGEN RNeasy Plant试剂盒分别提取沙柳全株、根、茎、叶、顶芽以及腋芽部位总RNA，利用Invitrogen SuperScript Ⅳ First-Stand Synthesis System反转录试剂盒反转录合成cDNA，冰箱中-20 ℃保存备用。

1.2.2 特异性引物设计及基因克隆

根据拟南芥PNY基因序列(AT5G02030)及杞柳(Salixpurpurea)基因组数据库(Phytozome 11)比对获得的同源序列(SapurV1A.1412s0040)，在UTR区设计特异性引物，由Thermo Fisher公司合成正向引物5′-CCCGTCCTCCTCTTCATCAAT-3′及反向引物5′-CGGAGGAACTGTGAAAATGACTG-3′，利用1.2.1反转录获得的cDNA为模板，采用50 μL体系全式金公司TransStart FastPfu试剂盒进行SpsPNY基因编码区序列(CDS)的扩增。扩增程序为92 ℃预变性3.0 min；92 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃继续延伸7 min；4 ℃保温。PCR产物经1%的琼脂糖电泳，利用Takara凝胶回收试剂盒回收目标片段，与pDONR222载体进行置换反应，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性菌株，Thermo Fisher公司测序拼接。

1.2.3SpsPNY基因生物信息学、进化树及RT-qPCR分析

通过NCBI的ORF(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线软件分析沙柳PNY基因的开放阅读框；利用Phytozome 11数据库搜索同源核苷酸及氨基酸序列；ExPASy(http://web.expasy.org/protscale/)在线预测亲水性和疏水性；ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)预测等电点、分子质量；在线软件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)预测二级结构。Singal P4.1预测信号肽，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/预测跨膜结构；T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)进行氨基酸多序列比对；MEME Suite(http://meme-suite.org/)进行氨基酸结构比对；利用MEGA6软件采用邻接法构建系统进化树，迭代1000次；利用在线亚细胞定位软件LOCTREE3(https://rostlab.org/services/loctree3/result.php?)和WOLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)进行亚细胞定位。利用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计并合成PNY基因表达特异检测正向引物5′-AATGCCGCTTCAGTTTCAGG-3′、反向引物5′-TCGTCCAAAATCTGCTGTGC-3′及内参UBQ基因正向引物5′-AAGCCCAAGAAGATCAAGCA-3′、反向引物5′-ACCACCAG CCTTCTGGTAAA-3′。采用宝生物公司SYBR Premix Ex Taq II试剂盒对沙柳根、茎、叶、顶芽、腋芽不同组织部位在Roche lightCycler 480Ⅱ仪器进行RT-qPCR检测，程序设置95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,45个循环，3次重复。Excel分析结果。

2 结果与分析

2.1 沙柳PNY基因的克隆及推导的氨基酸序列

以沙柳嫩枝cDNA为模板，用设计引物进行沙柳PNY基因的CDS序列扩增，扩增产物的CDS共1 446 bp，编码481个氨基酸(图1)，编码的蛋白质分子质量为53.7 ku，理论等电点为8.58。其中丝氨酸含量最多，占整个氨基酸序列的11.0%，其次为亮氨酸，占8.7%。该氨基酸序列无硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸。该蛋白的分子式为C2339H3674N678O722S26。预测半衰期为30 h。蛋白不稳定指数为50.62，说明该蛋白不稳定。

2.2 沙柳PNY基因编码的蛋白疏水性

通过ProtScale在线软件对PNY基因编码的蛋白进行疏水性分析。分析发现，该蛋白第131位氨基酸为异亮氨酸，疏水性最大，分值为1.844；第16位的氨基酸为赖氨酸，分值为-3.000，亲水性较好(图2)。图2中分值为负的氨基酸多于分值为正的氨基酸，也就是亲水性大于疏水性，因此可推测该蛋白为亲水蛋白。

2.3 沙柳PNY蛋白的二级结构及功能结构域预测

利用https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html在线预测PNY蛋白的二级结构。通过预测结果可知，该蛋白二级结构主要由无规卷曲(55.09%)、α-螺旋(29.73%)、延伸链(15.18%)组成(图3)。

图1 沙柳PNY基因序列及推导氨基酸序列

图2 PNY蛋白的疏水性预测

图3 PNY的二级结构预测

通过http://smart.embl-heidelberg.de/在线分析沙柳PNY蛋白的功能结构域。分析发现该蛋白包含POX结构域和Homeodomain结构域(图4)。由第114到229的116个氨基酸构成POX结构域，该结构域广泛存在于植物蛋白中，与同源异型结构域转录因子中的Homeodomain结构域有紧密关联，BEL1-like家族蛋白中多含有该结构域。由第277到341的65个氨基酸构成Homeodomain结构域，该结构域是识别同源异型结构基因家族的一个重要标志，该结构域形成螺旋-转角-螺旋结构，是与DNA结合的重要区域。

图4 PNY蛋白的功能结构域分析预测

2.4 沙柳PNY基因的氨基酸序列比对及系统进化树的构建

将沙柳PNY基因推导的氨基酸序列利用Blast与其他植物PNY基因的氨基酸序列进行同源性比对，结果显示：沙柳PNY基因与杞柳(SapurV1A.1412s0040.1)、毛果杨(Populustrichocarpa、Potri.010G197300.1)、拟南芥(AT5G02030.1)、番茄(Solanumlycopersicum、Solyc09g011380.2.1)的同源性分别为99.58%、94.20%、65.10%、75.44%。

利用Clustal Omega在线软件对以上几种植物PNY基因的氨基酸序列进行比对，结果表明：它们共有5个保守序列区域(图5)，其中保守序列区域Ⅱ内存在SKY结构域(虚线)，保守序列区域Ⅲ内存在BELL结构域(单横线)，保守区域IV内存在Homeodomain保守区结构域(双横线)。SKY、BELL、Homeodomain结构域均为GRAS基因家族BELL亚家族中PNY基因的典型保守区域[11，18-20]，由此可确认，沙柳中克隆获得的序列为PNY基因。

利用MEGA6对沙柳、杞柳(SapurV1A.1412s0040.1)、毛果杨(Potri.010G197300.1)、拟南芥(AT5G02030.1)、番茄(Solyc09g011380.2.1)、木薯(Manihotesculenta、Manes.07G122100.1)、大豆(Glycinemax、Glyma.18G189700.1)、马铃薯(Solanumtuberosum、PGSC0003DMT400049235)、水稻(Oryzasativa、LOC_Os01g62920.1)、高粱(Sorghumbicolor、Sobic.003G356200.1)、玉米(Zeamays、GRMZM2G154641_T01)等植物的PNY氨基酸序列进行系统进化树的构建及保守区域分析(图6)。由图6A可知，该基因家族共聚类为两大类，双子叶植物、单子叶植物各聚为一类；双子叶植物中沙柳、杞柳、毛果杨的亲缘关系更近，它们基本一致的氨基酸序列保守区域也印证了它们更近的亲缘关系(图6B)；单子叶植物的玉米、高粱的亲缘关系更近，氨基酸序列保守区域也基本一致。上述结果表明，在PNY基因的进化中，双子叶植物与单子叶植物具有一定的差异。杨、柳等木本植物与其他草本植物相比较，进化差异更为明显。

*为保守；：为次保守；I、II、III、IV、V为保守区域；虚线为SKY保守结构域；单横线为BELL保守结构域；双横线为Homeodomain保守结构域。

图5 沙柳PNY氨基酸与其他植物PNY氨基酸序列比对

图6 植物PNY基因的系统进化树(邻接法)及保守区域

2.5 沙柳PNY基因的组织特异性表达

以前期研究筛选出来的沙柳UBQ基因为内参，通过qRT-PCR对沙柳PNY基因在沙柳根、顶芽、叶、茎、腋芽部位的表达量进行测定。以SpsPNY基因在根中的相对表达量(1.07E-2)为参照，顶芽、叶、茎、腋芽中的PNY基因表达量分别是根的6.64、15.13、24.16、33.98倍，其中SpsPNY基因在腋芽部位表达量最高，其次是茎、叶、顶芽，根中的表达量最低。

3 结论与讨论

本研究由沙柳中克隆获得PNY基因，该基因含有1 446 bp的CDS序列，编码481个氨基酸。沙柳PNY基因的氨基酸序列与杞柳、毛果杨、拟南芥、番茄的同源性分别为99.58%、94.20%、65.10%、75.44%。通过对PNY氨基酸序列进行二级结构预测及保守区域分析可知，该蛋白包含PNY基因的典型保守区域SKY、BELL、Homeodomain结构域。

由系统进化树及氨基酸序列保守区域分析可知，沙柳与杞柳、毛果杨等木本植物PNY基因亲缘关系最近，与其他草本植物的亲缘关系有一定差异，氨基酸序列的保守区域的分布也是木本植物间最相似，而与草本植物同样存在明显差异。这些差异一方面表明，木本植物与草本植物PNY基因在进化中存在差异；另一方面表明，木本植物与草本植物的PNY基因功能可能存在一定差异。对草本植物中PNY功能的研究表明，PNY与KNOX蛋白特异结合，维持茎尖分生组织及器官分化、调节茎的节间发育、控制营养生长与生殖生长转化以及花、种子的发育[7，9-16]，但未见木本植物中PNY基因功能的相关研究。木本植物中该基因的表达及调控可能更为复杂，尤其对木本植物的次生生长及木材形成极有可能存在更为紧密的联系。

本研究通过qRT-PCR对沙柳根、茎、叶、腋芽、顶芽部位PNY基因进行相对定量分析，发现SpsPNY基因在腋芽部位表达量最多，其次为茎，根中含量最少。由pny拟南芥突变体表型可知，该突变体分枝数量增加[7，17]，该突变表型与沙柳腋芽部位PNY基因的高表达量很可能是存在因果关系的。此外，SpsPNY基因在沙柳茎中表达量也较高，表明该基因还可能对维持木本植物茎的次生生长有着重要作用。本研究前期对拟南芥pny突变体茎的显微结构研究发现，该突变体茎的木质部较野生型发达，形成层细胞活跃，韧皮部发育也较快[17]，因此推测该基因对调控植物茎的次生生长发育有着重要作用。为进一步证实该推测，还需采用基因敲除或超表达等研究手段，转化木本模式植物，验证基因功能。

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PNYGene Cloning, Bioinformatics and Tissue-specific Expression Analysis ofSalixpsammophila//

Yang Haifeng, Wang Wenjuan, Liu Le, Bu Songxue, Zhang Ya’nan, He Lijun

(Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：7-12.

Salixpsammophila;PNYgene; Bioinformation; Tissue specific expression

1)国家自然科学基金项目(31360187，31660216)；林木遗传育种国家重点实验室(中国林业科学研究院)开放课题(TGB2015001)。

杨海峰，男，1975年12月生，内蒙古农业大学林学院，副教授。E-mail:yang_hf888@163.com。

2016年8月2日。

S718.46

责任编辑：程 红。