家畜精子耐冻性机制研究进展

张树山，张德福，戴建军，吴彩凤

（上海农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106）

家畜精子耐冻性机制研究进展

张树山，张德福*，戴建军，吴彩凤

（上海农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106）

精子耐冻性的个体间差异性在不同家畜均普遍存在，制约着家畜精液冷冻保存技术的进一步发展。本文系统综述了近年来家畜精子耐冻性机制研究进展，以期为揭示家畜精子耐冻性机制提供参考。

家畜；精子；耐冻性

精液冷冻保存技术在家畜新品种培育方面具有重大意义，可使人工授精不受时空限制，更大程度地提高优良种公畜遗传资源的利用效率，但家畜精子耐冻性均存在不同程度的个体间差异，大大限制了精液冷冻保存技术在部分耐冻性较差的种畜群体中的应用。早期研究认为，在家畜精液预处理降温过程中，不同家畜个体精子对“低温打击”敏感度存在明显差异，这可能是造成公畜精子耐冻性不同的直接原因[1]。推测原因可能是不同种属或品种的精子质膜组成成分存在较大差异，然而确切的精子耐冻性影响机制仍不清楚。近十几年来，随着蛋白质组学和转录组学等研究手段在动物精子上应用日益成熟，使得从系统生物学的思路探索精子耐冻性影响机制成为可能，并取得了一些进展。本文对家畜精子耐冻性机制的相关研究方法及进展进行了综述，以期为揭示其影响机制及推动家畜精液冷冻保存技术发展提供借鉴。

1 人类及动物精子机理性研究的主要方法

早期在DNA水平研究发现，生理功能异常的精子很少有基因序列发生改变，而其生理功能异常可能是转录或翻译过程中造成的，故在DNA水平探索精子相关机制存在较大局限性[2]。蛋白质是细胞增殖、分化、衰老和凋亡等重大生命活动的执行者，生理功能的产生以及病理性变化往往由蛋白质群体甚至整体共同完成。RNA是DNA和蛋白质之间进行遗传信息传递不可少的“媒介”，RNA和DNA在生命的进程中均扮演着重要的角色。近几年来，蛋白质和RNA微量提取、相关定性与定量的高通量检测等技术相继问世以及生物信息学飞速发展，使得在蛋白质和RNA水平对精子通过比较分析研究探索其生理功能异常成为可能。目前，高通量的蛋白质组学和转录组学技术已广泛用于人类及家畜精子研究领域。

1.1 蛋白质水平 自蛋白质组学研究手段问世以来，研究者就开始将其应用于男性不育及动物繁殖研究。除精子外，精浆作为精子的天然培养基，其中的精浆蛋白也是重要研究对象。对动物精子蛋白和精浆蛋白通常采用比较蛋白质组学的研究思路，即通过对精子/精浆蛋白在不同空间、不同时间上动态变化着的蛋白质组进行比较，分析不同蛋白质组之间的蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异。双向电泳（Two-dimensional Electrophoresis，2-DE）对极酸或极碱蛋白、分子量极大（大于200 ku）或极小（小于10 ku）蛋白及难溶蛋白的分离存在局限性，且操作稍繁琐、重复性差等。目前，iTRAQ等新的高通量、精准的蛋白质定性与定量技术已逐步取代2-DE-质谱体系，成为蛋白质组学研究的普遍手段。

迄今为止，比较蛋白质组学已广泛地应用在人类[3]和几乎所有家畜[4]精子研究中，在探索男性不育机制及寻找一些家畜精子生理功能相关标记蛋白等方面取得了较大突破，建立了较成熟的针对精子/精浆蛋白质提取、分离、鉴定以及生物信息学分析以及进一步对重要蛋白进行细胞内定位、功能等深入研究的技术体系。在男性不育方面，早期研究者利用2-DE电泳-质谱技术体系建立了不育男性和正常男性差异精子蛋白数据库，并从中发现了一些重要功能蛋白[5]。在家畜上，一些研究者利用2-DE电泳结合蛋白质定量检测手段发现了一些与家畜性别相关的精子蛋白[6]。如Huang等[7]研究猪冷冻精子解冻后精子蛋白的变化，发现热休克蛋白-90（HSP-90)）解冻后含量明显下降，推测该蛋白可能与精子运动性能相关；也有研究发现，公猪精子中存在一些与母猪窝产仔数高度相关性的标记蛋白，表明公猪是育种工作中提高窝产仔数指数不可忽视的因素[8]。

精浆作为动物精子的天然培养基，其中的蛋白即精浆蛋白在精子整个生理过程尤其在受精过程发挥着不可忽视的作用，也已引起研究者们的广泛关注。研究已证实，在人[9]和家畜[10]等精浆中均存在种类丰富的蛋白，可能通过与精子表面结合来对精子产生影响，被认为是男性不育及雄性动物生殖障碍潜在的诊断标记。其中，Brandon等[11]在马精浆中发现4种蛋白与公马的生育能力相关；Bergeron等[12]认为绵羊精浆中的Spermadhesin族蛋白可能对精子获能及精卵结合均有影响；Huang等[13]在猪精浆中发现1个热应激蛋白HSP-70在高温季节明显降低，后证实HSP-70与猪子受精能力存在相关性。Caballero等[14]发现低浓度的Spermadhesin族蛋白PSP-I/PSP-II的异质二聚体可以延长高倍稀释猪精液的存活时间。此外，有研究也发现人类及家畜精浆中存在一些具有抗菌功能的蛋白（即抗菌肽）在维持精子正常生理功能中发挥着重要不可忽视的作用，精液中的抗菌肽提取、鉴定及生物合成也已成为当前生殖生物学领域一个研究热点[15]。

1.2 RNA水平 随着生命科学研究步入功能基因组学时代，在RNA水平研究特定生理功能状态下细胞或组织基因的表达情况和调控规律，已成为一个重要的研究热点。目前，RNA水平主要研究对象为mRNA、miRNA和lncRNA等，其中后二者为非编码RNA，研究手段主要有基因芯片（Biochip或Microarray）和RNA-Seq等高通量方法。基因芯片方法将提取RNA反转录为cDNA并进行荧光探针标记，通过检测芯片上各点信号强弱衡量该探针目的基因的表达量，可以快速分析大量样本，该技术局限性是分析高度依赖已知的基因组信息。而RNA-Seq测序技术不再需要设计探针，可对任意物种的整体转录产物进行检测，可以揭示小RNA和新基因，已成为目前在RNA水平进行深入研究不可缺少的工具。

早期普遍认为，精子发生后转录功能处于停滞状态，在被致密包装精子中染色质存在RNA的可能性很小。但随后研究相继发现，成熟精子不仅有种类繁多的RNA，且精子RNA在精子发生和存活及精卵结合等过程中都起着重要作用，并可能作为遗传物质进入卵母细胞[16]。然而，精子中的RNA含量极低，鱼精蛋白和DNA等被高度压缩且受细胞膜包裹，使得精子RNA提取一直是制约相关研究发展的瓶颈。近几年来，精子RNA提取和扩增技术的突破以及高通量RNA-Seq技术有力地推动了精子在RNA水平研究。

精子RNA水平研究早期在男性不育领域较多，基因芯片（cDNA Microarrays）和高通量测序等手段先后广泛应用，是男性不育生成机制及诊断研究发展的重要推动因素之一。在家畜中，转录组学在牛精子的相关研究中涉及较多。研究者们利用抑制消减杂交法（Suppression-Subtractive Hybridization，SSH）和基因芯片等技术在牛上进行了生育能力相关精子基因的筛选[17]。

近几年来，无编码功能的miRNA的生物学功能开始受到重视。已有研究证实，miRNA可通过其靶基因与相关信号通路建立相互调控及协同模式，间接实现了对细胞或生物体生理功能的调控[18]。在现有技术条件下，结合现有芯片技术和高通量测序技术，可实现高效、大规模地发掘，并对序列信息已知和未知miRNA进一步研究其基因调控功能。

通过对精子miRNA表达谱进行比较分析，也是探索男性不育及动物精子生理功能异常机制的有效途径之一。在男性不育方面，Liu等[19]和Wang等[20]分别利用miRNA芯片和Solexa测序在男性精子和精浆中发现不育相关miRNA ；在哺乳动物方面，Lagos-Quintana等[21]首次报道在老鼠精子中发现影响胚胎发育的miRNA；Fagerlind等[22]在奶牛上筛选并鉴定了7个与生育力相关miRNA；在猪精子中[23]也已发现5个与精子形态和运动性能相关miRNA。

此外，研究者也发现RNA或蛋白发挥其生理调节功能均涉及众多的信号通路，如miRNA被认为是基因调控和信号通路网络中不可缺少的调节器，通过其靶基因与相关信号通路建立了相互调控及协同模式，间接实现了对细胞或生物体生理功能的调控[24]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）[25]即为与猪精子功能调控相关的重要信号通路。

2 家畜精子耐冻性机制研究动态

关于家畜精子耐冻性影响机制，研究者们先后在DNA、RNA和蛋白质等水平分别从精子和精浆着手展开研究并取得了一些进展。在分子水平上，Thurston等[2]利用应用限制性片断长度多态（Restriction Fragment Length Polymorphism，AFLP）方法发现16个猪精子耐冻性相关的候选基因，但阐明其确切机制仍存在较大局限性。

研究发现，动物精子经冷冻-解冻过程会发生精子蛋白缺失、表达水平异常等，意味着精子比较蛋白质组学研究可能是揭示其耐冻性影响机制的一条途径[26]。在蛋白质水平上，猪[27]和牛[28]等家畜的精子/精浆蛋白与其精子耐冻性之间存在显著相关性。不同家畜个体的精浆在精液降温过程中可增强抗“低温打击”能力，推测可能是某些精浆蛋白在降温过程中发挥着主要作用[29]。在牛上，有研究发现精浆中BSP族蛋白不仅影响精子运动性能，还可能通过在冷冻前降温平衡过程增强其精子抗“低温打击”能力从而影响精子的耐冻性[30]；Barrios等[31]和Rickard等[32]均证实在不同品种绵羊中存在一些与精子耐冻性相关的精浆蛋白。与其他家畜相比，猪精子在品种间和个体间耐冻性差异最为显著[33]。在猪精子耐冻性方面，西班牙Bonet教授研究团队先后利用免疫标记（Immunolabeling Assay）、双向荧光差异凝胶电泳（2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis，2D-DIGE）结合 Western blot技术分离、鉴定了多个猪精子耐冻性相关蛋白[34]；Vilagran等[35]研究发现，皮特兰猪的精浆蛋白fibronectin-1（FN1）与猪精子耐冻性存在相关性，可以作为评价精子耐冻性的标记蛋白。国内对精子耐冻性在蛋白质水平上研究仅见张欣宗等[36]报道，该研究利用2D-MS技术对在人精子/精浆的蛋白进行分离、鉴定和生物信息学分析，共计发现22个可能与人精子耐冻性相关的精子/精浆蛋白。

基于精子RNA水平研究是揭示一些精子奥秘的重要途径之一，研究者也已展开了在RNA水平探索动物精子耐冻性影响的机制研究。Card等[37]首次将RNA –Seq技术引入牛冷冻精子，对由冷冻-解冻导致表达发生显著变化的mRNA进行高通量筛选，并对其中的PRM1和HMGB4等进行了分析与验证；Fraser等[38]证实了猪冷冻精子与常温保存精子间mRNA表达水平存在显著差异。笔者所在研究团队利用RNA –Seq和iTRAQ手段分别在RNA和蛋白水平筛选、分析和鉴定耐冻性相关RNA和蛋白（待发表 ）。

3 展 望

随着蛋白质组学及转录组学等高通量手段的飞速发展及其在人类和家畜精子中广泛应用，使得在DNA、RNA以及蛋白质多个水平，以系统生物学的思路全面地探索家畜精子耐冻性影响机制成为可能。预期在不久的将来，家畜精子耐冻性影响机制将逐渐揭下面纱，家畜精液冷冻保存技术将实现质的突破，从而推动家畜精液冷冻保存技术在种质资源保护、育种和生产中广泛应用，在提升优秀种公畜种用价值乃至新品种培育等方面均有较大意义。

[1]Waterhouse K E, Hofmo P O, Tverdal A,et al. Within and between breed differences in freezing tolerance and plasma membrane fatty acid composition of boar sperm[J].Reproduction, 2006, 131(5): 887-894.

[2]Thurston L M, Siggins K, Mileham A J,et al. Identification of amplified restriction fragment length polymorphism markers linked to genes controlling boar sperm viability following cryopreservation[J]. Biol Reprod, 2002, 66(3):545-554.

[3]Samanta L, Swain N, Ayaz A,et al. Post-translational modifications in sperm proteome: The Chemistry of Proteome diversifications in the Pathophysiology of male factor infertility[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1860(7):1450-1465.

[4]Hendriksen P J M, Welch G R, Grootegoed J A,et al.Comparison of detergent-solubilized membrane and soluble proteins from flow cytometrically sorted X- and Y-chromosome bearing porcine spermatozoa by high resolution 2-D electrophoresis[J]. Mol Reprod Dev, 1996,45(3): 342–350.

[5]Naaby-Hansen S, Flickinger C J, Herr J C. Two-dimensional gel electrophoretic analysis of vectorially labeled surface proteins of human spermatozoa[J]. Biol Reprod, 1997,56(3): 771-787.

[6]Spaulding G F. Methods for determining antibodies specific for sex associated sperm membrane proteins:US,5,660,997[P/OL]. 1997-08-26[2017-06-07]. http://www.freepatentsonline.com/5660997.html.

[7]Huang S Y, Kuo Y H, Lee W C,et al. Substantial decrease of heat-shock protein 90 precedes the decline of sperm motility during cooling of boar spermatozoa[J].Theriogenology, 1999, 51(5): 1007-1016.

[8]Kwon W S, Oh S A, Kim Y J,et al. Proteomic approaches for profiling negative fertility markers in inferior boar spermatozoa[J]. Sci Rep, 2015, 5: 1-10.

[9]Agarwal A, Ayaz A, Samanta L,et al. Comparative proteomic network signatures in seminal plasma of infertile men as a function of reactive oxygen species[J].Clin Proteomics, 2015, 12(1): 1-20.

[10]Killian G J, Chapman D A, Rogowski L A. Fertilityassociated proteins in Holstein bull seminal plasma[J].Biol Reprod, 1993, 49(6): 1202-1207.

[11]Brandon C, Heusner G, Caudle A,et al. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of equine seminal plasma proteins and their correlation with fertility[J].Theriogenology, 1999, 52(5): 863-873.

[12]Bergeron A, Villemure M, Lazure C,et al. Isolation and characterization of the major proteins of ram seminal plasma[J]. Mol Reprod Dev, 2005, 71(4): 461-470.

[13]Huang S Y, Kuo Y H, Lee Y P,et al. Association of heat shock protein 70 with semen quality in boars[J]. Anim Reprod Sci, 2000, 63(3-4): 231-240.

[14]Caballero I, Vazquez J M, Gil M A,et al. Does seminal plasma PSP-I/PSP-II spermadhesin modulate the ability of boar spermatozoa to penetrate homologous oocytes in vitro?[J]. J Androl, 2004, 25(6): 1004-1012.

[15]Schulze M, Junkes C, Mueller P,et al. Effects of cationic antimicrobial peptides on liquid-preserved boar spermatozoa[J]. PLoS One, 2014, 9(6): 1-9.

[16]Georgiadis A P, Kishore A, Zorrilla M,et al. High quality RNA in semen and sperm: Isolation, analysis and potential application in clinical testing[J]. J Urol, 2015, 193(1):352-359.

[17]Arangasamy A, Kasimanickam V R, DeJarnette J M,et al.Association of CRISP2, CCT8, PEBP1 mRNA abundance in sperm and sire conception rate in Holstein bulls[J].Theriogenology, 2011, 76(3): 570-577.

[18]Liu Y, Huang T, Zhao X,et al. MicroRNAs modulate the Wnt signaling pathway through targeting its inhibitors[J].Biochem Biophys Res Commun, 2011, 408(2): 259-264.

[19]Liu T, Cheng W, Gao Y,et al. Microarray analysis of microRNA expression patterns in the semen of infertile men with semen abnormalities[J]. Mol Med Rep, 2012,6(3): 535-542.

[20]Wang C, Yang C, Chen X,et al. Altered profile of seminal plasma microRNAs in the molecular diagnosis of male infertility[J]. Clin Chem, 2011, 57(12): 1722-1731.

[21]Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A,et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J]. Curr Biol,2002, 12(9): 735-739.

[22]Fagerlind M, Stalhammar H, Olsson B,et al. Expression of miRNAs in bull spermatozoa correlates with fertility rates[J]. Reprod Domest Anim, 2015, 50(4): 587-594.

[23]Curry E, Safranski T J, Pratt S L. Differential expression of porcine sperm microRNAs and their association with sperm morphology and motility[J]. Theriogenology, 2011,76(8): 1532-1539.

[24]Isobe T, Hisamori S, Hogan D J,et al. miR-142 regulates the tumorigenicity of human breast cancer stem cells through the canonical WNT signaling pathway[J]. Elife,2014, 18(3):1-23.

[25]de LIera A H, Martin-Hidalgo D, Gil M C,et al. AMPK activation reduces motility and regulates other functions of boar spermatozoa[J]. Mol Hum Reprod, 2014, 21(1): 31-45.

[26]Martin G, Cagnon N, Sabido O,et al. Kinetics of occurrence of some features of apoptosis during the cryopreservation process of bovine spermatozoa[J]. Hum Reprod, 2007, 22(2): 380-388.

[27]Casas I, Sancho S, Ballester J,et al. The HSP90AA1 sperm content and the prediction of the boar ejaculate freezability[J]. Theriogenology, 2010, 74(6): 940-950.

[28]Moura A A, Koc H, Chapman D A,et al. Identification of proteins in the accessory sex gland fluid associated with fertility indexes of dairy bulls: a proteomic approach[J]. J Androl, 2006, 27(2): 201-211.

[29]Torres M A, Ravagnani G M, Leal D F,et al. Seminal plasma arising from the whole boar sperm-rich fraction increases the stability of sperm membrane after thawing[J].J Anim Sci, 2016, 94(5): 1906-1912.

[30]Magalhaes M J, Jr, Martins L F, Senra R L,et al.Differential abundances of four forms of Binder of SPerm 1 in the seminal plasma of Bos taurus indicus bulls with different patterns of semen freezability[J]. Theriogenology,2016, 86(3): 766-777.

[31]Barrios B, Fernandez-Juan M, Muino-Blanco T,et al.Immunocytochemical localization and biochemical characterization of two seminal plasma proteins that protect ram spermatozoa against cold shock[J]. J Androl,2005, 26(4): 539-549.

[32]Rickard J P, Leahy T, Soleilhavoup C,et al. The identification of proteomic markers of sperm freezing resilience in ram seminal plasma[J]. J Proteomics, 2015,126: 303-311.

[33]Casas I, Sancho S, Briz Met al. Freezability prediction of boar ejaculates assessed by functional sperm parameters and sperm proteins[J]. Theriogenology, 2009, 72(7): 930-948.

[34]Yeste M, Estrada E, Casas I,et al. Good and bad freezability boar ejaculates differ in the integrity of nucleoprotein structure after freeze-thawing but not in ROS levels[J].Theriogenology, 2013, 79(6): 929-939.

[35]Vilagran I, Yeste M, Sancho S,et al. Comparative analysis of boar seminal plasma proteome from different freezability ejaculates and identification of Fibronectin 1 as sperm freezability marker[J]. Andrology, 2015,3(2):345-356.

[36]张欣宗, 熊承良. 影响人类精子耐冻性的蛋白质分析[J].中华男科学杂志, 2013, 19(3): 214-217.

[37]Card C J, Anderson E J, Zamberlan S,et al. Cryopreserved bovine spermatozoal transcript profile as revealed by highthroughput ribonucleic acid sequencing 1[J]. Biol Reprod,2013, 88(2): 1-9.

[38]Fraser L, Brym P, Pareek C S. Isolation of total ribonucleic acid from fresh and frozen-thawed boar semen and its relevance in transcriptome studies[J]. S Afr J Anim Sci,2017, 47(1): 56.

Research Progress on the Mechanism of Domestic Animals Sperm Freezability

ZHANG Shu-shan, ZHANG De-fu*, DAI Jian-jun, WU Cai-feng

(Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences; Division of Animal Genetic Engineering, Shanghai Key Laboratory of Agri-Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China)

Great inter-individual difference in domestic animal sperm freezability was found and it limited the development of semen cryopreservation technology. This paper summarized the recent development of sperm freezability in domestic animals so as to provide a reference for the revelation of sperm freezability mechanism.

Domestic animal; Sperm; Freezability

S814

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-009

2017-06-12；

2017-08-21

上海市自然科学基金（15ZR1430100）；上海市科委农业成果转化专项（123919N0700、133919N1700）

张树山（1976-），男，博士，副研究员，研究方向为动物繁殖生物技术，E-mail：smalltreexj@126.com

*通讯作者：张德福（1963-），男，博士，研究员，研究方向为动物繁殖生物技术，E-mail：zhangdefuzdf@163.com