CIK细胞对LLC小鼠肺癌细胞株诱导凋亡的影响

李福智 梁 帅 熊茂林 王宇彤 张克剑 侯 阳

(锦州医科大学附属第三医院胸外科，辽宁 锦州 121001)

CIK细胞对LLC小鼠肺癌细胞株诱导凋亡的影响

李福智 梁 帅1熊茂林1王宇彤1张克剑2侯 阳3

(锦州医科大学附属第三医院胸外科，辽宁 锦州 121001)

目的探讨干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2及CD3抗体诱导细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对LLC小鼠肺癌细胞株存活率和凋亡相关因子14-3-3ζ及p-Bad蛋白表达的影响。方法常规CIK细胞的体外培养方法培养CIK细胞为效应细胞，LLC小鼠肺癌细胞株为靶细胞，通过复合培养体系(Transwell培养板)将CIK细胞与LLC小鼠肺癌细胞株建立共培养体系。根据培养时间不同分3组(10、15、20 d)运用四甲基唑蓝(MTT)比色法检测LLC小鼠肺癌细胞的存活率。Western印迹检测CIK细胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表达变化。结果光镜下观察发现，成功地诱导出CIK细胞。培养20 d时LLC肺癌细胞的存活率明显低于10 d组和15 d组(Plt;0.01)。Western印迹检测LLC小鼠肺癌细胞中14-3-3ζ、p-Bad的表达均有下调。结论随着培养时间的延长CIK细胞对LLC小鼠肺癌细胞的存活率逐渐降低并能促进LLC小鼠肺癌细胞的凋亡。

CIK 细胞；LLC小鼠肺癌细胞株；14-3-3ζ；p-Bad

肺癌已经成为各种癌症中导致死亡的首要原因〔1〕。目前，我国肺癌发病率每年增长26.9%〔1〕。目前各种肿瘤的免疫细胞治疗非常活跃〔2～4〕，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。1991年美国斯坦福大学Sdmfidt-Wolf等首次报道了细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。他们采用多种细胞因子，由非贴壁的单个核细胞诱导出具有高增殖能力和高细胞毒性的杀伤细胞〔5〕。14-3-3蛋白是一种高度保守的可溶性酸性蛋白家族，参与细胞周期、信号传导、细胞凋亡及恶性转化的调控〔6〕。14-3-3ζ可以通过不同机制对凋亡产生抑制效应，其中之一就是对Bcl-2家族的调控〔7〕。Bad是促凋亡因子，在肿瘤中的表达具有重要意义。本文旨在探讨CIK细胞对LLC小鼠肺癌细胞株凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1材料 LLC小鼠肺癌细胞株(LLC)购自中国科学院细胞库。属上皮样肺腺癌细胞。CIK细胞来源于健康人外周血单个核细胞(PBMC)，由锦州医科大学附属第三医院体检中心提供。加样器GILSON(法国)、生物显微镜Olympus(日本)、倒置显微镜Olympus(日本)、加湿CO2孵箱Thermo SCIENTICFIC(德国)、生物安全柜HEAL FORCE HFsafe-1200(上海)、主要试剂Transwell培养板Corning Incorporated(美国)、噻唑蓝(MTT)Sigma公司、DMEM(培养基)GIBCO公司、胎牛血清(FBS)GIBCO公司、Percoll分离液华美生物工程公司、P-Bad兔多克隆抗体Santa cruz公司、14-3-3ζ、兔多克隆抗ASCAM公司、蛋白marker NEB公司、CD3单克隆抗体美国。

1.2方法 LLC小鼠肺癌细胞株的培养：在倒置显微镜下观察整体细胞的生长情况，可见细胞贴壁生长，细胞状态尚可。放置培养箱中静置4～5 h，可进行传代。弃去培养液以防止残留培养液中的血清对胰蛋白酶的抑制作用，用磷酸盐缓冲液(PBS，不含钙、镁离子)洗2次。加1 ml胰酶消化液置培养瓶中，倒放37℃培养箱或室温25℃以上，消化1～4 min。之后翻转培养瓶10～30 s后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况：见细胞大部分变圆、胞质回缩，细胞间隙增大。迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加完全培养基(RPMI-1640培养基+10% FBS、100 μ/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素)终止消化。按5 ml/瓶补加入完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中继续培养。LLC小鼠肺癌细胞株的冻存方法：冻存液90% FBS，10%二甲基亚砜(DMSO)。梯度降温：4℃，15～20 min；-20℃ 30～40 min。见细胞悬液结冻后，放入-80℃冰箱最后储存于液氮中长期保存。

1.3CIK效应细胞的制备 CIK细胞的体外培养方法〔8〕：取健康者PBMC 30 ml,将其收集于装有肝素瓶中，37℃室温存放即可转移至超净台上。用移液器转移至装有淋巴细胞分离液的离心管中，注意外周血需要放在淋巴细胞的上层。12 000 r/min离心15 min。用0.9%生理盐水1∶1稀释混匀，12 000 r/min离心15 min。取细胞层，生理盐水在12 000 r/min漂洗10 min弃上清，再漂洗1次。离心和洗涤均完成后，弃上清再将其移至IMDM培养液中(含10%FBS)悬浮细胞，置175 cm2培养瓶中培养。第1天加入rh干扰素(rhIFN)-γ 1 000 U/ml，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h。第2天加50 ng/ml的抗CD3单克隆抗体、300 U/ml的rhIL-2继续培养。每3 d半量换液，同时补加300 U/ml的白细胞介素(IL)-2，调细胞浓度至1×106个/ml。

1.4实验分组 以CIK细胞为效应细胞，LLC小鼠肺癌细株为靶细胞，通过复合培养体系(Transwell培养板)将CIK细胞与LLC小鼠肺癌细胞建立培养体系。设立正常对照组和空白对照组。根据培养时间不同分3组(10 d、15 d、20 d)运用MTT比色法检测LLC肺癌细胞的存活率，Western印迹检测CIK细胞14-3-3ζ、p-Bad蛋白表达变化。

1.5MTT比色法检测LLC小鼠肺癌细胞活力 测定共培养10、15、20 d LLC肺癌细胞活力。调整靶细胞LLC小鼠肺癌细胞浓度5×104/ml，加入96孔板内，200 μl/孔，24 h后换液。检测前3 h换成相应的无血清培养基。培养至3 d时进行检测。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml用PBS配制，pH7.4)10 μl，37℃继续孵育3 h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。重复5次，取其均值，计算细胞存活率。

1.6Western印迹检测LLC小鼠肺癌细胞中14-3-3ζ、p-Bad表达变化 收集在7 d的Lewis肺癌细胞(密度为2×106个/ml)，离心，PBS冲洗。加入细胞裂解液60～100 μl，短暂振荡。冰上作用30 min，12 000 r/min离心5 min。弃上液，提取培养液中的蛋白质样品，Bradford法测定浓度。在120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中进行电泳分离后，电转移法将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极板上。将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡。将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡。润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。盖上顶层电极板，接通正负极电源，15 V(不超过25 V)转印20 min。配封闭液。取出PVDF膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇1 h以上。倒掉封闭液，洗膜液略洗一下。取15 ml离心管加入用5 ml杂交液，按适当比例稀释一抗。PVDF膜在含有50 g/L脱脂奶粉的Tris盐缓冲液(TTBS)中37 ℃封闭90 min，依次加入一抗(抗人CD3、 CD56单克隆抗体，抗体稀释浓度为1∶1 000)，4℃孵育过夜。取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5 min。倒掉TBST，把PVDF膜放入装有二抗(辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG，抗体稀释浓度为1∶1 000)37℃作用40 min。TTBS充分漂洗(10 min×3次)后，化学荧光法(BCIP/NBT混合液)显色，观察结果，进行凝胶图像分析。

1.7统计学方法 应用SSPSS17.0软件进行单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1LLC小鼠肺癌细胞在光镜下观察 细胞贴壁生长，细胞已完全伸展，细胞形态呈梭形或类似成纤维状。CIK细胞在刚培养时细胞呈悬浮生长，大小均一，折光性强。5 d时可见细胞体积增大，部分细胞出现集落生长。12 d时细胞数量开始增多，光镜下可见胞核增大，胞质增多。

2.2MTT比色法检测共培养后LLC小鼠肺癌细胞存活率 培养20 d时LLC小鼠肺癌细胞的存活率〔(60.32±1.02)%〕明显低于10 d〔(79.23±1.22)%〕、15 d〔(69.45±1.34)%〕、空白对照组〔(95.52±0.22)%〕和正常对照组〔(100.00±0.00)%〕。结果培养不同时间(10 d、15 d、20 d)LLC小鼠肺癌细胞组与空白对照组和正常对照组，差异均有显著性(Plt;0.01)。

2.3Western印迹检测14-3-3ζ、p-Bad蛋白的表达 取10 d组，15 d组、20 d组不同培养时间的LLC小鼠肺癌细胞，进行Western印迹检测LLC小鼠肺癌细胞中14-3-3ζ、p-Bad蛋白含量的变化，β-actin为内对照。结果显示LLC小鼠肺癌细胞中14-3-3ζ、p-Bad的表达均降低。

3 讨 论

肺癌是起源于支气管黏膜上皮的恶性肿瘤，临床上常分为非小细胞肺癌及小细胞癌两大类，其中非小细胞肺癌约占75%。近年来肺癌的发病率呈明显上升趋势，现已为我国男性发病率最高的恶性肿瘤。肺癌的发病年龄大多在40岁以上，男性居多，但女性肺癌的发病率近年来明显增加。早期肺癌通过手术等综合治疗，治愈率可以达到50%以上，但是仍然面临复发、转移等棘手问题。因此肺癌的早发现、早诊断、早治疗，以及术后复发、转移的尽早发现与治疗,是肺癌获得根治的关键和难点之一。CIK细胞选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒性。CIK细胞杀瘤谱广、杀瘤效率高、对化疗耐药肿瘤同样敏感。同时具有免疫杀伤活性强且持久。

本研究结果提示，CIK细胞能够降低体外培养LLC小鼠肺癌细胞的存活率，CIK细胞可分泌大量的Th1类细胞因子〔9〕。CIK细胞作为最终的效应细胞，可以通过MHC非限制性途径〔10〕发挥对肿瘤细胞的直接杀伤作用，而对正常细胞没有影响。CIK细胞是诱导、激活的自体细胞，在共培养的过程中CIK细胞可致DC高表达特异性的抗原提成分子，促进DC大量分泌IL-12等细胞因子，进而增强CIK细胞的细胞毒性，并能成功诱导Th1型免疫应答，达到清除肿瘤细胞的目的。CIK细胞具有独特的功能，可以选择性地杀伤肿瘤细胞，杀瘤效率高且对正常细胞没有毒性，即使对化疗耐药的肿瘤也同样敏感。

CIK细胞共同表达了CD3和CD56两种膜蛋白分子,是目前所知杀伤活性最强的一种肿瘤生物治疗效应细胞〔4〕,研究认为CIK细胞对肿瘤的杀伤作用是通过释放颗粒酶、穿孔素而裂解靶细胞,对靶细胞的裂解是CIK细胞杀伤靶细胞的主要机制,也有学者认为进入体内活化的CIK细胞可分泌多种细胞因子如干扰素γ、肿瘤坏死因子和IL-2等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,而且还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细〔5,6〕。

凋亡受到抑制，才导致细胞出现异常增殖而发展为肿瘤细胞。14-3-3蛋白家族可以和许多信号蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体等结合，在信号传导、细胞周期及细胞凋亡的调控等方面发挥重要作用。14-3-3ζ是该家族中的一个亚型，其确切功能还不完全明了，目前对14-3-3ζ的研究主要集中在它对凋亡的调控上。有研究发现，在非小细胞肺癌中存在14-3-3ζ的高表达，且降低14-3-3ζ的表达可使体外实验的癌细胞活性减弱。本实验表明DC-CIK细胞可以降低体外培养Lewis肺癌细胞中14-3-3ζ蛋白的表达。Bad在许多人类正常组织中都有表达，在睾丸、乳腺、结肠和脾内有较高水平的稳定表达。Bad在生存期较长的位于基底膜的基底细胞表达密度较低，而在向表面迁移的分化细胞中密度较高，表明Bad在分化细胞中有促凋亡作用。另外Bad是多种刺激引起激酶的普遍靶点，这些外界刺激包括生长因子、细胞因子、可诱导细胞内钙升高的药物和介导腺苷酸环化酶的神经递质等。14-3-3ζ蛋白在细胞凋亡过程中的具体作用及其机制目前尚无定论，但有学者研究发现，14-3-3ζ可以竞争性地与p-Bad结合，导致p-Bad丧失了与Bcl-XL和Bcl-2结合的机会，进而启动一系列下游反应并最终抑制了细胞凋亡的发生。因此认为，DC-CIK细胞可能是通过上述机制降低了14-3-3ζ和p-Bad蛋白的表达，促进了体外培养Lewis肺癌细胞的凋亡，进而阻止了癌细胞的无限增殖。

1Jemal A，Bray F，Center MM，etal.Global cancer statistics 〔J〕.CA Cancer J Clin，2011;61(2):69-90.

2Hoffman DM,Gitlitz BJ，BeUdegrun A，etal.Adoptive cellular therapy〔J〕.Semin Oncol,2000;27(2)：221-33.

3Sa YL，Hua YK Yan XM，etal.The preliminary clinical application of Adoptive immunotherapy with auto-cytokine induced killer cells in the patients with malignant solid tumor〔J〕.Pratical J Cancer,2006;21(1)：11-4.

4孙 薏，陈 健，蔡 鹏，等.用抗原特异性树突状细胞激活的淋巴细胞治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤〔J〕.中国实验血液学杂志,2010;18(1)：219-23.

5Schmidt-Wolf IG,Negrn RS,Kiem HP,etal.Use 0f SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokinc induced killer cells with potent antitunor cell activity〔J〕.J Exp Med,1991;174(1):139-49.

6Zhao J,Meyerkord CL,Du Y,etal.14-3-3 proteins as potential therapeutic targets 〔J〕.Semin Cell Dev Biol,2011;22(7):705-12.

7Kanno T,Nishizaki T.Sphingosine induces apoptosis in hippocampal neurons and astrocytes by activating Caspase-3/-9 via a mitochondrial pathway liked to SDK/14-3-3 protein/Bax/cytochrome c 〔J〕.J Cell Physiol,2011;226(9):2329-37.

8任 欢,邢淑贤,徐红薇,等.CIK 的体外增殖及体内杀瘤活性的实验研究〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,1999;6(1):17-21.

9Marten A,Ziske C,Schottker B,etal.Interaction between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to an activation of both populations〔J〕.J Immunother,2001;24(6):502-10.

10Verneris MR,Karami M,Baker J,etal.Role of NKG2D signaling in the cytotoxicity of activated and expanded CD8+T cell〔J〕.Blood,2004;103(8):3065-72.

〔2017-04-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

R734.2

A

1005-9202(2017)22-5549-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.027

辽宁省教育厅2016年省级大学生创新创业训练计划项目(20161060044)

1 锦州医科大学基础医学院 2 吉林省肿瘤医院胸外一科

3 锦州医科大学生命科学研究院

侯 阳(1982-)，女，讲师，主要从事肿瘤免疫研究。

李福智(1982-)，男，主治医师，主要从事肺癌的发病机制与转移研究。