胃癌患者CD4+和CD8+T细胞的PD-1高表达与肿瘤免疫逃逸的关系

何 芳 王 芳 张艳婷 李 鹏 杨少奇

(宁夏医科大学总医院消化科，宁夏 银川 750004)

胃癌患者CD4+和CD8+T细胞的PD-1高表达与肿瘤免疫逃逸的关系

何 芳 王 芳 张艳婷 李 鹏 杨少奇

(宁夏医科大学总医院消化科，宁夏 银川 750004)

目的探讨胃癌患者CD4+和CD8+T细胞的程序性死亡受体(PD)-1与肿瘤免疫逃逸的关系。方法采用流式细胞术检测胃癌患者外周血中CD4+、CD8+T细胞的PD-1表达情况；分析胃癌患者外周血单核细胞PD-L1表达情况；比较胃癌组织、胃癌患者外周血与健康人胃黏膜中CD4+、CD8+T细胞的PD-1表达情况；酶联免疫吸附(ELISA)分析胃癌组织中表达PD-1阳性与PD-1阴性的CD4+、CD8+T细胞因子分泌情况。结果胃癌患者外周血中CD4+、CD8+T细胞PD-1表达和单核细胞的PD-L1表达均显著高于对照组(Plt;0.05)；胃癌组织中CD4+、CD8+T细胞表达的PD-1显著高于胃癌外周血和正常人胃黏膜中的PD-1表达；胃癌组织中PD-1阳性的CD4+，CD8+T细胞分泌的相关细胞因子干扰素(IFN)γ、白细胞介素(IL)-17、granzymeB，肿瘤坏死因子(TNF)显著低于PD-1阴性。结论胃癌患者体内CD4+、CD8+T细胞高表达PD-1抑制了T细胞的功能，促进胃癌的免疫逃逸。

流式细胞术；T细胞；免疫逃逸；胃癌

程序性死亡受体(PD)-1是表达于被活化的CD4+与CD8+T细胞表面的免疫抑制性受体〔1，2〕。PD-L1与PD-L2是PD-1的配体〔3，4〕。PD-1/PD-L1的相互作用对于维持正常机体的外周免疫耐受中有重要作用〔5〕。研究表明，实体瘤中PD-L1的表达阻碍T细胞的抗肿瘤免疫反应〔6〕。在多种小鼠模型中的研究也发现，阻断了PD-L1抑制肿瘤生长或延迟其发展进程〔6〕。胃癌死亡率高居全球第二位〔7〕。免疫系统无法驱动对胃癌细胞的免疫反应〔8,9〕。然而，对于胃癌是如何战胜机体免疫反应的机制目前还知之甚少。本文通过检测CD4+与CD8+T细胞上PD-1的表达情况，探究胃癌免疫逃逸的可能机制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 细胞培养基(RPMI,10%FBS,55 μmol/L 2-mercaptoethanol,2 mmol/L L-glutamine,10 μg/ml gentamicin，10 μmol/L HEPES)流式分析仪器：BD公司的Calibure。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒与流式荧光抗体均购自ebioscience公司。

1.2受试者样本 选取宁夏医科大学总医院2016年1～12月住院行手术治疗的胃癌患者，病理活检明确诊断为胃癌。年龄42～76岁，自愿参加本研究，研究前均未接受放射性治疗、化疗或其他治疗。健康体检人群为对照组，经医院伦理委员会批准。

1.3外周血单个核细胞提取 取受试者15 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)梯度离心。

1.4肿瘤浸润淋巴细胞提取 将术后病理标本切碎，用2 mg/ml胶原酶D(Roche)消化，37℃，1 h，得到的细胞悬液用200目滤膜过滤。

1.5流式细胞术分析样品的制备

1.5.1细胞刺激 将分离得到的细胞重悬在1 ml 细胞培养基中，加入50 ng/ml PMA和1 μg/ml离子霉素，37℃细胞培养箱中刺激4 h后收上清，用ELISA试剂盒测细胞因子含量。

1.5.2流式抗体标记 将细胞重悬在200 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，按照1×106细胞标2 μl流式抗体。置于4℃冰箱中避光孵育20 min，用1 ml PBS洗1次。见300 μl PBS上流式仪器分析。

1.6统计学方法 应用Graph Pad Prism5.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1胃癌患者外周血中CD4+与CD8+T细胞PD-1表达 胃癌患者外周血中CD4+T细胞所表达的PD-1显著高于对照组(32.4%±10.2% vs 24.6%±7.5%，P=0.008 3)。胃癌患者外周血中CD8+T细胞所表达的PD-1也显著高于对照组(29.7%±9.2% vs 20.3%±6.8%，P=0.005 3)。

2.2胃癌患者外周血中CD4+单核细胞PD-L1表达 胃癌患者外周血中CD4+单核细胞中表达的PD-L1显著高于对照组(16.5%±7.5% vs 4.4%±1.7%，Plt;0.000 1)。晚期胃癌外周血中CD4+单核细胞PD-L1的表达也显著高于早期胃癌患者(21.2%±8.1% vs 12.9%±4.9%，Plt;0.000 1)。

2.3PD-1在胃癌组织CD4与CD8T细胞中的表达 胃癌组织CD4+T细胞表达PD-1(60.5%±10.5%)显著高于胃癌患者外周血(21.8%±7.9%)与正常人胃黏膜的(46.5%±9.3%，Plt;0.000 1，P=0.003 1)。胃癌组织CD8+T细胞表达PD-1(57.6%±10.2%)显著高于胃癌患者外周血(20.3%±7.3%)与正常人胃黏膜的(42.7%±9.8%，Plt;0.000 1，P=0.002 3)。

2.4胃癌组织中表达PD-1的CD4+与CD8+T细胞功能 PD-1阳性的CD4+T细胞分泌干扰素(IFN)γ〔(46.2±3.3)pg/ml〕与白细胞介素(IL)-17〔(21.7±1.6)pg/ml〕显著少于PD-1阴性的CD4+T细胞〔(103.5±4.8)pg/ml，(42.8±3.1)pg/ml；P=0.004 3，P=0.002 7〕。PD-1阳性的CD8+T细胞分泌IFNγ〔(16.3±2.1)pg/ml〕、granzymeB〔(15.7±1.3)pg/ml〕、肿瘤坏死因子(TNF)-α〔(7.8±0.5)pg/ml〕也显著少于PD-1阴性的CD8+T细胞〔(53.5±2.9)pg/ml，(32.9±2.6)pg/ml，(22.5±2.2)pg/ml；Plt;0.000 1，P=0.003 9，P=0.001 6〕。

3 讨 论

共信号分子是表达于细胞表面的糖蛋白，能够直接调控T细胞受体的信号通路。基于其功能特性，可以将共信号分子分为共刺激分子与共抑制分子，分别是刺激T细胞活化或抑制T细胞活化。在恰当的时间与位置上表达共信号分子，可以促进或抑制T细胞免疫反应，包括影响T细胞的生长，分化和功能成熟。PD-1和PD-L1分别是共信号分子与共抑制分子。结合了配体PD-L1与PD-L2后，PD-1会传递共抑制信号。通过抗体阻断PD-1信号通路能够增加体内的病毒特异CD8+T细胞的免疫反应，增强CD8+T细胞的增殖，细胞因子产生，效应活性，使病毒量降低。最近的一项研究表明，被病毒感染的失能T细胞高表达PD-1，通过阻断PD-1信号通路后能够增强T细胞体外免疫反应〔10〕。另外，癌症患者里T细胞功能的受损似乎与表达PD-1相关〔10〕。然而，在胃癌患者中，PD-1表达的情况还有待被阐明。本研究结果提示，上调PD-1表达与肿瘤环境中CD4+与CD8+T细胞功能相关，并且PD-1的表达抑制了肿瘤环境中CD4+与CD8+T细胞的免疫反应。PD-L1在多种肿瘤中都表达，是免疫抑制环境中的一种成分〔11〕。尽管未检测胃癌细胞中PD-L1表达情况，在最近的研究中已经发现，胃癌细胞中高表达PD-L1与胃癌患者不良的预后效果相关〔12〕。而PD-L1通常表达于抗原提呈细胞，如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞等。

1Urban JL,Schreiber H.Tumor antigens〔J〕.Annu Rev Immunol,1992;10:617-44.

2Sharpe AH,Wherry EJ,Ahmed R,etal.The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection〔J〕.Nat Immunol,2007;8(3):239-45.

3Tseng SY,Otsuji M,Gorski K,etal.B7-DC,a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells〔J〕.J Exp Med,2001;193(7):839-46.

4Latchman Y,Wood CR,Chernova T,etal.PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation〔J〕.Nat Immunol,2001;2(3):261-8.

5Keir ME,Freeman GJ,Sharpe AH.PD-1 regulates self-reactive CD8+T cell responses to antigen in lymph nodes and tissues〔J〕.J Immunol,2007;179(8):5064-70.

6Hirano F,Kaneko K,Tamura H,etal.Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity〔J〕.Cancer Res,2005;65(3):1089-96.

7Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer J Clin,2005;55(2):74-108.

8Inoue H,Mori M,Honda M,etal.The expression of tumor-rejection antigen ''MAGE'' genes in human gastric carcinoma〔J〕.Gastroenterology,1995;109(5):1522-5.

9Hoshino T,Seki N,Kikuchi M,etal.HLA class-I-restricted and tumor-specific CTL in tumor-infiltrating lymphocytes of patients with gastric cancer〔J〕.Int J Cancer,1997;70(6):631-8.

10Matsuzaki J,Gnjatic S,Mhawech-Fauceglia P,etal.Tumor infiltrating NY-ESO-1-specific CD8+T cells are negatively regulated by LAG-3 and PD-1 in human ovarian cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2010;107(17):7875-80.

11Brown JA,Dorfman DM,Ma FR,etal.Blockade of programmed death-1 ligands on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production〔J〕.J Immunol,2003;170(13):1257-66.

12Wu C,Zhu Y,Jiang J,etal.Immunohistochemical localization of programmed death-1 ligand-1(PD-L1)in gastric carcinoma and its clinical significance〔J〕.Acta Histochem,2006;108(1):19-24.

〔2017-04-16修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)22-5505-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.009

宁夏自然科学基金项目(No.NZ15150)

杨少奇(1973-)，男，博士，主任医师，主要从事消化道肿瘤、慢性肝病研究。

何 芳(1981-)，女，硕士，主要从事消化道癌症相关研究。