P-Cx43在人胶质瘤细胞中的表达及其与肿瘤细胞增殖相关性研究

姬云翔,王业忠,赵 冬,董江涛,田卫东,王刚刚

(石河子大学医学院第一附属医院神经外科，新疆石河子 832000)

P-Cx43在人胶质瘤细胞中的表达及其与肿瘤细胞增殖相关性研究

姬云翔,王业忠△,赵 冬,董江涛,田卫东,王刚刚

(石河子大学医学院第一附属医院神经外科，新疆石河子 832000)

目的 探讨磷酸化缝隙连接蛋白43(P-Cx43)在人脑胶质瘤细胞中的表达水平及其与肿瘤细胞增殖的相关性。方法 该科2013年6月至2014年6月手术切除内减压正常脑组织10例作为对照组，同时间段切除人脑胶质瘤标本63例为试验组。应用HE染色、免疫组化法确定胶质瘤性质等级，通过Ki-67的染色反映肿瘤细胞增殖情况。采用蛋白质印迹法(Western blot)技术检测P-Cx43的表达。结果 研究发现，在正常脑组织中，P-Cx43的表达较WHO Ⅰ级胶质瘤中表达略低，但二者差异无统计学意义(P=0.140)，其余各组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。在各组之间P-Cx43表达差异有统计学意义(P<0.01)，呈现逐渐增加的趋势。结论 P-Cx43与肿瘤细胞活性和胶质瘤恶性进展密切相关。

细胞增殖；连接蛋白类；细胞系,肿瘤；脑胶质瘤

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，其5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第三位[1]。随着影像技术的不断进步，该肿瘤的检出率日趋增高，因其恶性程度高、术后易复发、预后差等特点，严重威胁人类健康。胶质瘤发生的确切病因尚不清楚。最近几年，一些学者研究发现，连接蛋白及其形成的缝隙连接细胞间通讯与肿瘤发生、增殖、侵袭和转移有密切的关系，在其中起关键作用[2-3]。与肿瘤联系最为密切的缝隙连接蛋白43(Cx43)[4-5]。研究表明，胶质瘤增殖水平与Cx43基因表达有相关性[6-7]；但磷酸化Cx43(P-Cx43)水平与胶质瘤细胞增殖关系的研究罕有报道。本研究立足于胶质瘤发生、发展及其生物学特征相关的基因蛋白表达，对比研究胶质瘤恶性程度与P-Cx43水平的关系，探寻脑胶质瘤新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本科2013年6月至2014年6月手术切除内减压正常脑组织10例作为对照组，同时间段切除人脑胶质瘤标本63例为试验组。每例胶质瘤标本分成两部分：冰冻保存一部分，以备试验使用；另一部分供病理分型。根据世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类标准[3]，确定标本类型，其中提供试验标本40例。WHO Ⅰ级10例：毛细胞星形细胞瘤7例，室管膜下巨细胞星形细胞瘤3例；WHO Ⅱ级10例：少突胶质细胞瘤4例，弥漫性星形细胞瘤6例；WHO Ⅲ级10例：间变性少突胶质细胞瘤5例，间变性少突星形细胞瘤3例，间变性室管膜瘤2例；WHO Ⅳ级10例：胶质母细胞瘤4例，髓母细胞瘤4例，胶质肉瘤2例。

1.2 主要试剂 人Ki-67免疫组化试剂盒，一抗鼠抗人Ki-67单克隆抗体，一抗小鼠抗人Cx43抗体，兔抗人P-Cx43抗体，二抗兔抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记和山羊抗兔辣根过氧化物酶标记，牛血清白蛋白(BSA)，蛋白Marker，磷酸化蛋白抑制剂，化学增强发光试剂盒，0.45 μm PVDF膜、丙烯酰胺、β-actin、TEMED、APS、SDS、溴酚蓝等。

1.3 方法

1.3.1 病理检查 所有术中切除标本送病检后，应用HE染色、免疫组化法明确肿瘤性质及细胞增殖情况，并根据WHO胶质瘤病理级别判定标准对标本进行分级。免疫组织化学染色(S-P 法)-20 ℃恒冷冰冻切片5 μm，丙酮4℃固定15 min，3% H2O2甲醇孵育15 min、血清封闭40 min，鼠抗人Ki-67单克隆抗体以1∶100的比例稀释，4 ℃过夜，二抗室温孵育80 min，HRP标记链霉卵白素工作液室温孵育60 min，DAB溶液显色，苏木素复染，封片。PBS代替一抗作阴性对照。Ki-67免疫组化涂片：每例镜下随机采集10个视野，以镜下Ki-67阳性细胞百分比和染色强度的乘积评分。(1)着色细胞占细胞计数百分率小于5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；(2)无染色计0分，染色强度淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；(3)二者计分相乘即阳性等级，0分提示阴性(-)，1～4分提示弱阳性性(+)，5～8分提示阳性(++)，9～12分提示强阳性(+++)。

1.3.2 蛋白质印迹法(Western blot) 1 000 μL组织裂解液、冷冻脑胶质瘤组织进行匀浆，裂解后，在 4 ℃，12 000 r/min条件下离心10 min。取上清液分装后再加入蛋白上样缓冲液，100 ℃加热，使其变性8 min，置于-20 ℃保存备用。采用 Western blot检测P-Cx43的表达。在恒压下，进行凝胶电泳，取出胶版。电泳后通过湿法电转移方法转移至PVDF膜上，封闭2 h。封闭结束，洗膜5次×5 min。用5%BAS按1∶1 000稀释第一抗体，将膜与一抗置孵育袋中4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜3次×10 min。用5%BSA稀释按1∶20 000稀释第二抗体，于室温下孵育2 h。孵育完成后洗膜3次×10 min。膜于化学发光检测试剂反应2 min，取出膜，甩去多余的液体，感光、显影、定影。

2 结 果

2.1 病检HE染色：Ⅰ级胶质瘤细胞显示神经元细胞形态正常，排列规则，胞质饱满，细胞核染色较正常，见图1；Ⅱ级胶质瘤细胞显示神经细胞稀疏，排列较规则，数量无减少，神经细胞胞质浓缩红染，胞核紫染，见图2；Ⅲ级胶质瘤细胞显示神经细胞数量稀少, 排列不规则、紊乱稀疏，间质水肿疏松，神经细胞胞质浓缩红染，胞核皱缩，见图3；Ⅳ级胶质瘤细胞显示神经细胞消失、稀疏, 排列不规则、紊乱，数量明显减少，间质水肿疏松，神经细胞胞质浓缩红染，胞核皱缩或溶解、碎裂，见图4。免疫组化染色：Ki-67阳性表现为胞核棕黄或棕褐色染色，Ki-67在正常脑组织中表达呈阴性，随着胶质瘤级别升高，Ki-67染色细胞数目明显增加；Ki-67(-)未见胞核棕黄或棕褐色染色，见图5；Ki-67(+)胞核少量棕黄或棕褐色染色，见图6；Ki-67(++)胞核中量棕黄或棕褐色染色，见图7；Ki-67(+++)胞核大量棕黄或棕褐色染色，见图8。

图1 WHOⅠ级 HE染色(×200)

图2 WHOⅡ级 HE染色(×200)

图3 WHO Ⅲ级 HE染色(×200)

图4 WHO Ⅳ级 HE染色(×200)

图5 WHOⅠ级 Ki-67(-)

图6 WHOⅡ级 Ki-67(+)

2.2P-Cx43表达 伴随胶质瘤恶性程度的增加，P-Cx43的表达逐渐升高(P<0.05)，见图9。

图7 WHO Ⅲ级 Ki-67(++)

图8 WHO Ⅳ级 Ki-67(+++)

1：正常脑组织;2～5：分别为WHOⅠ～Ⅳ级胶质瘤。

图9P-Cx43在各组中表达

2.3 等级资料Ki-67在不同级别胶质瘤的表达差异有统计学意义(P<0.01)，呈现递增态势，见表1。

表1 Ki-67在不同级别胶质瘤中表达和相关性(n)

表2 各组P-Cx43的表达情况

2.4 单因素方差分析 各组P-Cx43的表达差异有统计学意义(P<0.01)，胶质瘤等级增加，P-Cx43表达呈递增的态势，见表2。正常脑组织中P-Cx43表达较WHOⅠ级差异无统计学意义(P=0.140)，其余各组间的表达差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.5P-Cx43与Ki-67表达的相关性P-Cx43和Ki-67表达秩相关(spearman)系数为0.769 9，二者之间呈正相关(P<0.01)。

3 讨 论

作为颅内最常见肿瘤的胶质瘤，其生物学特性各异，因级别、性质不同有极大的变异性。检测肿瘤增殖活性，对于了解肿瘤分化情况、预测生物学行为、评估预后和抉择治疗方案均有非凡的意义。目前细胞增殖标记物应用最普遍，敏感性及特异性相对较高的是Ki-67。在细胞有丝分裂的整个周期中，均有Ki-67表达，对细胞增殖数量能够更全面、更精确地反映，而且其半衰期短，出现假阳性结果的概率小，因此比评价细胞增殖活性的其他检测方法更具优势。研究表明，随着胶质瘤WHO级别升高，肿瘤的恶性程度就越高，其Ki-67的表达就越高，反映肿瘤组织的增殖活性能力就越强[8-9]。本研究结果与既往研究相符，进一步证实胶质瘤增殖潜能与Ki-67的表达呈正相关。

近年来，诸多肿瘤基础研究方面发现，连接蛋白、缝隙连接细胞间通讯对肿瘤的发生、发展起到重要调控作用。细胞间隙连接通讯是细胞间信息直接交流的方式，是以细胞间隙连接(gapjunction，GJ)为路径构成的。GJ也是细胞间信息直接交流的惟一膜通道结构，除分化了的骨骼肌、红细胞及睾丸中成熟的精子细胞外，GJ在所有实质性器官或组织中也广泛存在。通道蛋白Cxs组成GJ。Cxs是一种蛋白质，具有结构相似而相对分子质量不同的多基因家族编码。在哺乳动物及人体中发现Cxs共有21种。依相对分子质量不同，Cxs命名划分为：Cx26、Cx32、Cx37、Cx43等。目前，GJ在细胞活动、内环境稳定的维持、生长和发育调控等生命过程中被证明发挥十分关键的作用；链接蛋白表达变化和细胞间缝隙通讯功能异常，均会导致包括肿瘤等多种疾病的发生[2-3]，是一种极具研究价值的肿瘤治疗新靶点[10]。多项研究已表明Cx43与肿瘤的发生、转移和治疗均有紧密联系[11-12]。因此，对Cx43表达的调控可以作为对肿瘤生物学特性控制的方法之一。

连接蛋白大半可归属于磷蛋白，只是它们的磷酸化水平不同。磷酸化是蛋白转录后常见的一种修饰，调控细胞间信号转导方式主要是通过蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用，并调控着许多细胞内过程。这些过程可能参与涉及Cx转运、组装、解离、降解及通道的门控等各个环节。目前研究证实，P-Cx43与肝癌的发生[13]、卵巢上皮癌的生物学特性密切相关[14]。但少见P-Cx43水平与胶质瘤细胞增殖关系的报道。

本研究通过对标本进行P-Cx43表达水平检测，发现：对照组脑组织P-Cx43均呈现低表达，在低级别胶质瘤细胞中也仅仅是部分表达，随着胶质瘤级别升高，P-Cx43表达水平呈上升趋势(P<0.05)。P-Cx43水平在胶质瘤中，随着肿瘤恶性程度的增加而升高，与其增殖程度呈正相关。本研究认为，在低级别胶质瘤中，P-Cx43受到某种机制的阻碍，而在高级别胶质瘤中，P-Cx43的能力被极大提高，导致其蛋白表达显著升高。种种迹象均提示：在Cx43蛋白磷酸化过程中存在某种协同调节细胞增殖周期的机制，可以促进肿瘤细胞的增殖活性。

P-Cx43可能有促进胶质瘤发生及向高级别转化作用，而Cx43抑制胶质瘤发生、发展。已有研究显示miRNA可间接调节脑胶质瘤的生长和发育。Jin等[15]研究显示miR-125通过抑制Cx43部分地促进胶质瘤生长。如此，就可以假设增加Cx43的表达可以抑制胶质瘤的发生。Yu等[16]对此进行了实验验证，他们对胶质瘤细胞引入外源性Cx43，可逆转胶质瘤细胞的恶性表现，甚至可逆转胶质瘤干细胞的恶性表现。调控miRNA识别特定的目标mRNA和转录后水平促进Cx43翻译从而抑制胶质瘤发生，那么假设抑制或阻滞Cx43磷酸化是否可以减缓胶质瘤的生长甚至抑制其发生，miRNA是否参与P-Cx43基因表达，它们之间存在怎么样的联系，种种假设和疑问还有待进一步研究。

综上所述，P-Cx43水平变化与人胶质瘤细胞增殖性密切相关，这可能是由于多种致癌因素协同参与了肿瘤的发生、发展。在这一领域深入研究，可以进一步了解胶质瘤生物学病因提供重要途径。

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Expression of phosphorylation gap junction protein 43 in human glioma and correlation with tumor cell proliferation

JiYunxiang,WangYezhong△，ZhaoDong,DongJiangtao,TianWeidong,WangGanggang

(DepartmentofNeursurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

Objective To explore the expression of phosphorylation gap junction protein 43(P-Cx43) level in human gliomas and correlation with tumor cell proliferation.Methods Ten cases of normal brain tissue from June 2013 to June 2014 in Department of Neursurgery were chosen as control group,63 cases of glioma were resected in the same period of time was experience group.HE staining and immunohistochemistry were used to determine the grade of gliomas,and the proliferation of tumor cells was determined by Ki-67 staining.The expression of P-Cx43 protein was detected by Western blot technique.Results It was found that in normal brain tissue,the expression of P-Cx43 was slightly lower than that WHO Ⅰ in gliomas,but there was no significant difference between the two groups(P=0.140),there were significant differences among the other groups(P<0.05).There was a significant difference in P-Cx43 expression between the groups (P<0.01),showing a gradually increasing trend.Conclusion The P-Cx43 protein was closely related to the activity of tumor cells and the malignant progression of gliomas.

cell proliferation;junction proteins;cell line,tumor;brain glioma

姬云翔(1979-)，主治医师，硕士，主要从事神经系统肿瘤和脑血管病研究。△

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.016

R739.41

A

1671-8348(2016)36-5091-04

2016-07-18

2016-09-06)