MicroRNA-203对胶质母细胞瘤干细胞生物学特性的作用研究

秦忠宗 邓一帆 祝刚 晏广

(惠州市中心人民医院神经外科，广东 惠州 516001)



MicroRNA-203对胶质母细胞瘤干细胞生物学特性的作用研究

秦忠宗 邓一帆 祝刚 晏广

(惠州市中心人民医院神经外科，广东 惠州 516001)

目的 观察胶质母细胞瘤干细胞表达miR-203后对其生物学特性的影响。方法 采用免疫磁珠分选出CD133+肿瘤干细胞，对其转染并表达miR-203，免疫荧光染色检测CD133等，实时定量RT-PCR检测巢蛋白(nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和微管相关蛋白2(MAP2)表达以鉴定其多向分化能力，成球实验评价其自我更新能力；最后采用CCK-8和流式凋亡分别检测miR-203对胶质母细胞瘤干细胞增殖和凋亡的影响。结果 培养并分选出的CD133+胶质母细胞瘤干细胞表达CD133和nestin标记物，且分化后表达星形胶质细胞标记物GFAP和神经元标志物MAP2，且CD133+细胞miR-203表达明显低于CD133-细胞(P<0.05)；miR-203转染两个7 d后CD133+肿瘤干细胞的一、二次成球数目均显著低于对照组细胞的成球数(P<0.05)；进一步实时定量RT-PCR检测示miR-203转染4 d后细胞CD133和nestin的mRNA和蛋白表达均明显降低，而GFAP和MAP2的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05)；miR-203转染24，48，72，96和120 h后细胞存活率均明显低于对照组细胞(P<0.05)；进一步流式检测示miR-203细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。结论 miR-203可能成为胶质母细胞瘤干细胞的分子治疗靶点。

胶质母细胞瘤； 干细胞； miR-203； 靶向治疗

胶质母细胞瘤是中枢神经系统中生存预后较差的恶性肿瘤，治疗后患者的生存期仅约为1年[1]。目前的研究[2]证明肿瘤干细胞在胶质母细胞瘤的发生发展和治疗抵抗中可能发挥了重要作用。MicroRNA是一条23 nt的非编码单链RNA，可与其靶向mRNA的3’末端非编码区(3’UTR)互补配对以下调基因表达，且已证明[3]其与多种肿瘤的发生发展有密切关系。miR-203在多种肿瘤中表达降低，其可能是一种抑癌miRNA[4-6],再者，胶质瘤患者中的miR-203低表达提示了预后不良。本研究旨在探讨miR-203对胶质母细胞瘤干细胞自我更新、多向分化能力、增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 原代培养 收集胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织于无菌离心管中，内含Neurobasal干细胞培养基(1∶50 B27 vitaminA添加剂、20 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L重组人表皮生长因子EGF、10 μg/L重组人白血病抑制因子、4 μ/L肝素和1∶100双抗青霉素/链霉素)，去除坏死组织液及血液，剪成0.5 mm3并加入0.1%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min，吹打至单细胞悬液，过滤后1 000 rpm离心5 min，加入红细胞裂解液处理3 min，离心收集细胞，接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2下培养。

1.2 分选CD133+干细胞并纯度测定 观察到悬浮细胞球达直径150～200 μm时用免疫磁珠细胞分选试剂盒及分选器，严格按照说明书行CD133的阳性细胞分选。收集细胞，按200 μL/108细胞加入免疫磁珠细胞分选液，吹打至单细胞悬液，同时按100 μL/108细胞加入与微磁珠结合的CD133抗体，4 ℃中结合30 min，并按1 mL/108细胞加入分选液清洗细胞，离心后弃上清收集细胞且按500 μL/108细胞加入分选液重悬；将结合作用后的细胞悬液加入分离柱中，加入2 mL分选液抽提，以冲洗出CD133阳性细胞。分选出的CD133阳性和阴性细胞分别加入50 μL CD133/2(293C3)-PE抗体或50 μL同型对照mIgG2b-PE抗体，流式细胞分析仪进行检测，以进行纯度测定。

1.3 分子鉴定 免疫荧光染色检测分选后细胞CD133、nestin的表达，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基诱导干细胞分化，检测分化后细胞星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元的标志物微管相关蛋白2(MAP2)的表达。

1.4 miR-203转染 人成熟miR-203与其对照的无意义寡核苷酸链(NC)严格按照使用说明转染CD133+干细胞。将带有红色荧光标记的miR-203和NC分别转染胶质母细胞瘤干细胞，并在转染48 h后荧光显微镜下行细胞计数，并统计细胞转染效率。转染后48 h，RT-PCR检测两组细胞的miR-203的表达。

1.5 成球实验 在转染miR-203和NC后，吹打至单细胞悬液并以1 000个/孔的细胞密度于96孔板中培养。培养基中7 d后，对每个孔进行细胞计数以记录形成的一次成球数目。再收集每个孔的细胞球，轻柔反复吹打至单细胞悬液，再次转染且计数，同样按1 000个/孔的细胞密度于96孔板中再培养7 d后，计数每个孔形成的二次成球数目。

1.6 转染后mRNA表达 转染miR-203和NC 4 d后，抽提细胞总RNA。逆转录反应为：27 ℃，9 min；37 ℃，120 min；85 ℃，5 min；最后降至4 ℃，cDNA保存于-80 ℃冰箱。使用荧光染料法进行mRNA的定量测定，严格按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒的说明书进行。荧光定量PCR扩增反应为：93 ℃，4 min预变性；93 ℃，20 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 sec；共循环40次。

1.7 细胞增殖实验及凋亡实验 收集分选鉴定后的胶质母细胞瘤干细胞，以10 000个细胞/孔细胞计数，分别转染miR-203和无意义寡核苷酸链NC，在转染后的24，48，72，96，120 h，采用CCK-8试剂盒进行细胞增殖活性的测定，并采用流式细胞分析仪进行转染miR-203和NC 3 d后细胞调亡实验检测，Cell Quest分析软件进行数据分析。

2 结 果

2.1 胶质母细胞瘤干细胞的培养、分选与鉴定 将收集的原代细胞置于干细胞培养基中约3～5 d后可见形成悬浮细胞球，并经免疫磁珠法分选得CD133+细胞，将细胞置于培养基中培养约3～5 d后形成神经干细胞样的细胞球(胶质母细胞瘤球)，7～9 d后胶质母细胞瘤球呈圆形或卵圆形，边缘清楚光滑，折光性较好。免疫荧光染色示胶质母细胞瘤干细胞广泛表达CD133和Nestin两种干细胞标记物(图1A～B)，诱导干细胞分化后细胞表达星形胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP2(图1C～D)。

2.2 miR-203在胶质母细胞瘤干细胞中的表达 RT-PCR检测示CD133-细胞中miR-203的表达较CD133+细胞显著性增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。对CD133+干细胞转染48 h后，在荧光显微镜下细胞计数，并统计红色荧光阳性细胞，得到miR-203组细胞的转染效率为(72.11±15.83)%；RT-PCR检测示转染miR-203组细胞的miR-203表达为NC组的(74.21±10.76)倍(n=3，P<0.05)。

2.3 miR-203对胶质母细胞瘤干细胞自我更新能力的影响 CD133+细胞转染7 d后miR-203组细胞球形成数量较少，体积也较小，按NC组细胞球数目为100%计算，一次成球miR-203组细胞球数目为(52.34±15.19)%，差异具有统计学意义(n=3，P<0.05)，二次成球miR-203组细胞球数目为(30.15 ± 9.27)%，差异具有统计学意义(n=3，P<0.05)。

2.4 miR-203对胶质母细胞瘤干细胞多向分化能力的影响 CD133+细胞转染后4 d，定量RT-PCR检测转染后miR-203和NC两组细胞的CD133、nestin、GFAP、MAP2的mRNA表达情况，与NC组比较，miR-203组细胞的CD133和nestin的mRNA表达明显降低，GFAP和MAP2的mRNA表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5 miR-203对胶质母细胞瘤干细胞增殖和凋亡的影响 与NC组比较，CD133+细胞转染miR-203组不同时间点的细胞存活率均显著性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(图3)。其中最小的细胞生存率出现在转染后72 h。与NC组(4.10±0.28)%比较，流式细胞仪检测示转染miR-203组的细胞凋亡率(11.87±1.66)%明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨 论

本研究首先从人胶质母细胞瘤的原位肿瘤组织中分离、培养、分选和鉴定得到了CD133阳性的胶质母细胞瘤干细胞，且可形成胶质母细胞瘤球，并可表达干细胞标记物CD133和nestin，也可诱导分化表达GFAP和MAP；再者，在CD133阳性胶质母细胞瘤干细胞中， miR-203均呈低表达状态，这提示了miR-203的低表达可能是胶质母细胞瘤干细胞的分子特征之一。某些miRNA的特异性表达可能代表着胶质母细胞瘤干细胞的不同起源，不同的miRNAs表达谱也就代表着胶质母细胞瘤干细胞的特有表型[7]。在进一步的功能实验中发现miR-203可以逆向调节着胶质母细胞瘤干细胞的特性，转染miR-203后干细胞的自我更新能力受限，再有miR-203促进干细胞分化为星形胶质细胞和神经元，并且可以抑制增殖和促进凋亡。研究[8]发现miR-203在U251胶质母细胞瘤细胞株中可以直接靶向作用于PLD2发挥其抑癌作用。目前PLD2基因的生物学作用逐渐被揭示，在HeLa细胞中发现PLD2增高可以激活ERK和p38 MAPK信号通路，且可以提高抗凋亡基因Bcl-2的表达以发挥其促癌作用。再者，PLD2在星形胶质细胞瘤中可以通过激活活性氧和p38 MAPK通路提高COX-2的表达发挥作用。

注：A.CD133+胶质母细胞瘤干细胞(免疫荧光染色，×400)；B.Nestin阳性的胶质母细胞瘤干细胞(免疫荧光染色，×400)；C.GFAP阳性的胶质母细胞瘤干细胞(免疫荧光染色，×400)；D：MAP2阳性的胶质母细胞瘤干细胞(免疫荧光染色，×400)。图1 胶质母细胞瘤干细胞荧光显微镜下形态学表现

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