运动诱导线粒体自噬与受体蛋白FUNDC1研究进展

高久翔 于亮

北京体育大学（北京 100084）

FUN14 domain containing 1（FUNDC1）作为哺乳动物细胞内的线粒体受体蛋白，在低氧条件下已被证实能够引起线粒体自噬。线粒体自噬对机体内环境稳态和细胞正常代谢至关重要，可调节多种疾病状态。运动作为一种应激干预能够激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）并在丝氨酸317（Ser-317）位点磷酸化自噬启动激酶UNC-51样激酶-1（ULK1），引起骨骼肌的线粒体自噬。目前线粒体自噬的分子机制主要集中在酵母细胞中Atg家族蛋白、PTEN诱导激酶1（PINK1）—帕金森氏病蛋白2（Parkin）途径、缺氧等应激条件下、以及哺乳动物网织红细胞中Bcl-2家族成员Bnip3L/Nix介导的线粒体自噬等。而FUNDC1在运动诱导的骨骼肌线粒体自噬中的作用尚未有明确报道，本文通过FUNDC1与AMPK通路的关系，针对其在运动诱导的骨骼肌线粒体自噬过程中的作用进行综述，为解释这种新型线粒体自噬的受体蛋白FUNDC1在AMPK信号通路中的作用提供新的论证。

1 FUNDC1结构

FUNDC1是哺乳动物细胞中的新型线粒体受体蛋白，包含155种氨基酸，是在缺氧条件下聚集的线粒体膜（mitochondrial-associated-membrane，MAM）蛋白，可与内质网驻留（endopllasmic reticulum，ER）蛋白中的新型钙联接蛋白（calnexin，CANX）相互作用[1]。FUNDC1含有3个跨膜结构域，以及暴露于胞质溶胶的N末端结构域和插入线粒体外膜的C末端结构域[2]。在胞质溶胶暴露的N末端含有特征性LIR基序，通常CANX的N末端与MAM上的FUNDC1的亲水结构域相连，线粒体外膜蛋白FUNDC1与微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein light chain，LC3）通过YxxL（LC3-Interacting Region，LIR）基序对线粒体自噬产生影响[3]，随着线粒体自噬进行，其从CANX解离并优选募集动力相关蛋白1（dynamin，DNM1L/DRP1）以驱动响应缺氧胁迫的线粒体分裂[1]。线粒体自噬受体FUNDC1不仅是新型MAM蛋白，并且是DNM1L的新的线粒体受体，促进线粒体碎裂和响应缺氧造成的线粒体自噬。

2 应激条件对FUNDC1介导的线粒体自噬的作用

线粒体在应激条件下会导致线粒体裂变或融合，线粒体应激通过线粒体自噬和凋亡刺激破坏上述复合物，线粒体的裂变或融合以及线粒体自噬是构成线粒体质量控制的重要组成部分[4]。在线粒体应激时，位于线粒体外膜的这些受体变为磷酸化或去磷酸化，以增强与LC3或其他自噬基因的相互作用，用于启动线粒体自噬。BNIP3L/Nix[3]和FUNDC1[5]已经被确定为哺乳动物细胞中的线粒体自噬受体，BNIP3作为促凋亡蛋白在因低氧导致的自噬和细胞死亡中起关键作用[6]。另外，BNIP3或BNIP3L/Nix的过表达在一系列应激下启动保护性自噬，可能是由于破坏了BCL2/BCL-XL和酵母Atg6同系物Beclin1[7]之间的关联所致，而FUNDC1则在低氧条件下引起线粒体自噬。在酵母细胞中的线粒体自噬受体Atg32[8]能够与Atg11彼此间产生作用，但与线粒体自噬启动的早期步骤形成的自噬体[9]有着明显差别。

2.1 饥饿对FUNDC1介导的线粒体自噬的调控

通常自噬可能是在减少营养供应或缺氧、高温、活性氧（Reactive oxidative species，ROS）等其他应激条件下激活以维持细胞内环境稳定。饥饿是自噬的最常见的触发因素，通常饥饿可以分为氨基酸饥饿和糖饥饿，通过自传感器监测细胞内营养状态，当缺少氨基酸或生长因子时可通过PI3K-mTOR途径诱导自噬[10]。在酵母细胞中，Atg32作为特异性酵母线粒体自噬感受器在氮饥饿条件下磷酸化并增强与Atg11的作用，特异性地参与降解受损或多余的线粒体[11]。当GFP-LC3转基因小鼠分离的肝细胞处于营养缺乏的培养基中时，自噬体大量吞噬线粒体[12]。AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]对运动能力及线粒体功能调控至关重要。在禁食过程中作为自噬的激活因子，AMPK可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）复合物并直接磷酸化FoxO3和ULK1。ULK1是因营养缺乏引发自噬的调节信号，在低糖情况下，AMPK通过磷酸化Ser-317和Ser-777直接激活ULK1促进自噬[13]。当营养充足时，mTOR作用ULK1的Ser-757位点，影响ULK1与AMPK之间的作用，阻止ULK1激活[14]。通常情况下，机体自噬水平较低，间歇性禁食作为一种新型减脂手段，除了具有控制体重的作用外，还可以通过适度激活AMPK-ULK1通路促进骨骼肌自噬，清除受损的细胞器或代谢废物，以维持骨骼肌质量[15]，根据实验结果推测其自噬连接蛋白同样可能为FUNDC1。

2.2 缺氧对FUNDC1介导的线粒体自噬的调控

氧是线粒体氧化磷酸化的重要代谢底物。线粒体通过消耗大量氧进行氧化磷酸化，缺氧对血管生成、代谢改变、细胞增殖、化学抗性等有重要的影响[16]。在缺氧期间由于细胞色素c氧化酶在电子传递链过程中缺乏O2而不能运输电子[2]导致线粒体和细胞的损伤，包括降低氧化磷酸化和细胞色素c氧化酶活性和增加ROS产生，在缺氧期间的这些损伤诱导了线粒体自噬。FUNDC1在缺氧的早期阶段结合钙联接蛋白（calnexin，CANX），然后从CANX解离并优先与DNM1L相互作用，而当缺氧时间延长，两种蛋白结合到FUNDC1的相同区域，在不同情况下竞争[1]。现已证实缺氧可在体内和体外触发自噬。在常氧情况下，酪氨酸蛋白激酶SRC可通过位于LIR基序中的酪氨酸Tyr-18促使FUNDC1磷酸化，而FUNDC1在低氧导致的线粒体自噬之前通常会发生SRC激酶的失活而去磷酸化[5]，致使线粒体自噬激活。研究表明，去磷酸化的FUNDC1对LC3具有更高的亲和力，从而增强FUNDC1-LC3相互作用和募集自噬机制以形成自噬体[10]。此外，FUNDC1还可以通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CK2在丝氨酸13（Ser-13）[10]处磷酸化，其机制是Ser-13在常氧下被CK2磷酸化，并且由线粒体定位的磷酸甘油酸变位酶PGAM5响应缺氧而去磷酸化，阻止和LC3之间的相互作用，影响随后的线粒体自噬。缺氧则影响FUNDC1这种线粒体自噬受体的可逆磷酸化，激活线粒体自噬。

随着缺氧时间的延长，线粒体膜蛋白如FUNDC1，TIMM23和TOMM20表达显著减少，但FUNDC1的降解比其他线粒体蛋白（包括TIMM23和TOMM20）快得多，这种降解可被蛋白酶体抑制剂MG132或自噬抑制剂氯喹抑制[17]，说明还存在其他机制调控FUNDC1与线粒体自噬之间的关系。在线粒体动态机制中，线粒体定位的RING-finger E3连接酶膜相关环指蛋白5[membrane-associated ring finger（C3HC4） 5，MARCH5]，通过泛素化DNM1L或通过泛素化和降解裂变受体FIS1和MIEF2抑制线粒体DNM1L的移位来抑制线粒体裂变。MARCH5在线粒体形态和线粒体自噬中发挥作用，MARCH5作为一种位于线粒体外膜上的E3连接酶，其特异性诱导FUNDC1降解。低氧环境能够引发MARCH5寡聚体的拆卸，同时促进了其与FUNDC1的相互作用，以响应在线粒体自噬之前的初始线粒体损伤，其依赖赖氨酸119（K-119）对FUNDC1的泛素化，基于MARCH5的泛素化和降解的FUNDC1减少了突发和过量的线粒体自噬，从而保护细胞线粒体。然而，随着缺氧时间的延长，FUNDC1残基会发生去磷酸化[18]。

3 运动对FUNDC1的调节

3.1 运动与AMPK

运动不但可以使线粒体的功能加强，还能通过对线粒体自噬的调控，维持线粒体质量和数量的稳定，保证其良好的功能状态。适宜运动有助于自噬能力增强，降解因运动刺激所产生的破损和衰老的细胞器以及合成或折叠错误的蛋白质，抑制骨骼肌和心肌细胞凋亡或死亡[12，19]，但是过量运动则会导致骨骼肌和心肌细胞损伤、疲劳，甚者对免疫功能产生影响，诱发自噬性细胞死亡[20]。运动可以影响骨骼肌能量代谢，运动过程中当AMP水平增高，ATP水平降低时，能量传感器AMPK被激活[21]。AMPK能够感受细胞内能量变化，调节细胞代谢以维持能量稳态。有研究表明，作为能量代谢总开关，运动过程中的能量消耗主要导致AMPKα的激活。这不仅可以对骨骼肌体积及肌纤维类型进行调控，还可以通过调节自噬相关因子，使LC3-I转化为LC3-II并减少自噬选择性底物p62的含量激活自噬，进而改变骨骼肌蛋白质降解水平[22]。

3.2 AMPK与ULK

AMPK不但可以磷酸化TSC2[23]和Raptor[24]，降低mTORC1的活性，还可以在Ser-317位点磷酸化自噬启动激酶ULK1，通过磷酸化ULK1、PI3K复合体促进自噬[14]。ULK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在酵母细胞中的同源物是 Atg1，Atg1和 Atg11、Atg13、Atg17、Atg29及Atg31形成复合体[25，26]，Atg1或者ULK1复合体都受到TOR或者mTORC1信号通路的调控。ULK1可通过两条途径实现其在自噬中的功能，一是通过激酶活性磷酸化其他蛋白，二是不依赖其激酶活性招募其他Atg蛋白。在酵母细胞中，TOR能通过磷酸化Atg1及Atg13破坏二者间的作用使自噬水平降低[25]。而在晡乳动物中，虽然mTORC1依然能磷酸化ULK1及mAtg13，但是并不破坏两者间的相互作用。哺乳动物因不存在Atg11、Atg17，Atg29及Atg31基因，可能存在其它蛋白对自噬进行调控。

3.3 ULK与FUNDC1

运动可以导致线粒体受损、能量代谢改变，使细胞能量降低从而激活AMPK，促进自噬发生。为保持线粒体的稳定，AMPK磷酸化ULK1对受损伤的线粒体进行选择性的清除，即线粒体自噬[27]。FUNDC1通过增强与LC3之间的结合能力，成为ULK1在选择性线粒体自噬中的新连接蛋白。通过缺氧或FCCP的刺激诱导线粒体自噬发生后，ULK1的表达水平与FUNDC1的磷酸化相关。Ser-17和Tyr-18是两个相邻位点，FUNDC1通过ULK1的Ser-17磷酸化激活，Ser-17的磷酸化促进线粒体自噬。然而Tyr-18磷酸化对于线粒体自噬起抑制作用，在缺氧条件下通过SRC激酶抑制ULK1与线粒体自噬的结合位点，即在LIR基序中通过对Tyr-18的磷酸化使FUNDC1介导的线粒体自噬受到影响，并通过ULK1降低Ser-17的FUNDC1的磷酸化[28]。可见线粒体自噬所必需的ULK1和FUNDC1是通过它们之间的协同作用调节线粒体自噬的，而运动是否通过启动AMPK磷酸化ULK1调节FUNDC1，仍需要深入研究才能得出结论。

4 FUNDC1在运动诱导线粒体自噬中的作用

线粒体作为ATP的来源，是机体生命活动的重要结构，运动特别是离心运动可以导致骨骼肌线粒体在肌膜下聚积，呈现大小不一，肌纤维内线粒体出现肿胀、嵴稀少，呈空泡化等严重结构异常。为了防止线粒体损伤，细胞可以通过启动保持线粒体健康的质量控制机制即线粒体自噬，在细胞代谢、应激反应和细胞死亡中起着重要作用，是正常的细胞稳态和功能的基础，也是运动发挥健康效应的机制之一。研究证明在哺乳动物细胞中线粒体的调节可以分为两种途径：第一种机制依赖于丝氨酸/苏氨酸激酶PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）和一种E3泛素蛋白连接酶帕金森氏病蛋白2（Parkinson protein 2，Parkin）[29]，其次依赖于线粒体外界的受体蛋白[30]。

4.1 运动介导的线粒体PINK1-Parkin自噬通路

到目前为止，已知在哺乳动物细胞中可以通过PINK1-Parkin途径介导线粒体自噬[16]，PINK1、Parkin可以通过调控线粒体质量的动态变化以及影响线粒体运动这两种方式进行调节。当线粒体膜电位丢失时，线粒体功能丧失信号，作为E3泛素连接酶的Parkin，PINK1-PARK2/Parkin通路在诱导线粒体自噬中起到重要作用[31]。内源性或异位表达的Parkin可以通过PINK1的相互作用被募集到去极化的线粒体[32]，但缺氧不会诱导Parkin转移到线粒体[17]。PINK1可以在Ser-65磷酸化Parkin，这是Parkin易位和随后的线粒体自噬的先决条件[33]，易位的PARK2泛素化许多线粒体外膜蛋白，以募集p62或与LC3相互作用的其他分子用于自噬体形成[34]，其后通过自噬机制将SQSTM1/p62转位至线粒体并吞噬片段化的线粒体或一部分线粒体，而Parkin突变体阻碍了线粒体质量控制，是帕金森病的产生原因。然而Jamart等[35]通过对8名超耐力运动员在一次24 h跑台运动实验后，发现骨骼肌PINK1、Parkin蛋白表达并未发生明显改变，而6周耐力训练可以使小鼠骨骼肌PINK1、Parkin中mRNA表达上调[36]，可见在运动诱导的线粒体自噬中PINK1/Parkin的作用可能为耐力训练引发线粒体自噬的敏感信号通路。

此外，活化的PINK1磷酸化Parkin，并泛素化线粒体外膜蛋白，包括线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）、线粒体融合蛋白（mitofusin 1，Mfn1）和线粒体融合蛋白（mitofusin 2，Mfn2）、以及招募自噬受体如视神经蛋白（optiueurin，OPTN）和卷曲螺旋蛋白 52（nuclear dot protein 52，NDP52）来调节线粒体的吞噬[37，38]。

4.2 运动介导的线粒体自噬与受体蛋白之间的关系

目前已经证实几种线粒体受体可以选择性地介导线粒体自噬，如ATG32是酵母中首次报道的线粒体自噬受体，介导ATG8的聚集使LC3在同系物中存在，吞噬受损线粒体的囊泡[39-41]。此外，一些核心自噬组件也在线粒体自噬调节中发挥重要作用，比如不存在Atg7或ULK1的情况下，网织红细胞内的线粒体清除就会减少[42]。在哺乳动物中，通过自噬的NIX（也称BNIP3L）依赖性方式消除线粒体是红细胞成熟的关键[43]，以达到选择性清除线粒体的作用。在红细胞成熟期间，BNIP3L/NIX及其同源物BNIP3与LC3之间的作用介导线粒体自噬，哺乳动物细胞中线粒体自噬的另一介体BCL2L13/BCL-RAMBO的活性受诱导或磷酸化的调节[44]。低氧条件下的线粒体自噬可以通过低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促进BNIP3介导的线粒体自噬保护机制，有效清除因低氧联合运动所损伤的线粒体，提高骨骼肌线粒体的结构功能[45]。

4.3 运动与FUNDC1之间的潜在关系

与其他自噬LC3受体蛋白有所差别，线粒体受体FUNDC1结合LC3和诱导线粒体自噬的能力受磷酸化负调控[16]。当低氧或者线粒体膜电势下降时，PGAM5作为线粒体表面膜蛋白FUNDC1的磷酸酶通过与FUNDC1的结合，降低FUNDC1 Ser13的磷酸化水平，Ser-13的去磷酸化可以增加FUNDC1与LC3之间的结合，并且降低PGAM5表达水平后可以有效地防止缺氧条件下在Ser-13处的FUNDC1的去磷酸化和线粒体蛋白的降解[46]，同时Tyr18也发生脱磷酸化，募集LC3和自噬膜泡包裹的线粒体，促进线粒体自噬。在哺乳动物中CK2能够磷酸化p62，调控选择性自噬，通过CK2抑制剂TBBt处理的HeLa细胞Ser-13处的FUNDC1磷酸化水平降低，说明CK2能磷酸化FUNDC1 Ser-13[47]。而酪氨酸蛋白激酶能通过磷酸化FUNDC1 Tyr-18，导致FUNDC1与LC3之间的关联减弱以及线粒体的自噬。并且，FUNDC1表现出的泛素化在暴露于缺氧的细胞中以时间依赖性方式显著增强。但关于Parkin是否介导FUNDC1泛素化和降解的研究发现，与FCCP治疗不同，缺氧不诱导GFP-Parkin转移到线粒体。Parkin的过表达未能增强HeLa细胞中的FUNDC1泛素化或降解[18]，表明在缺氧处理后，FUNDC1可以以非依赖Parkin的方式进行泛素化介导的降解。

运动导致线粒体受到损伤或破坏时，细胞能量降低激活AMPK，从而促进自噬，作为线粒体自噬所必需的ULK1和FUNDC1可以协同调节线粒体自噬，FUNDC1将ULK1募集到损伤的线粒体，其中ULK1的FUNDC1磷酸化对线粒体自噬起到决定性作用，ULK1与FUNDC1相互作用，使其在丝氨酸17处磷酸化，加强FUNDC1与LC3的结合，FUNDC1的ULK1结合缺陷突变体阻止ULK1转位到线粒体并对线粒体自噬产生影响[31]。此外，FUNDC1还可以依赖Atg5介导线粒体自噬，通过去表达Atg5发现可以阻断从LC3-I到LC3-II的变化并减少由FUNDC1介导的线粒体内膜蛋白TIM23，去表达BECN1也可以抑制雷帕霉素和饥饿诱导的自噬[48，49]，然而BECN1的去表达没有阻止FUNDC1诱导的线粒体自噬[50]。

5 小结

骨骼肌和线粒体分别作为运动时的动力来源和能量产生的工厂，为机体代谢的调控以及细胞内环境稳态起到重要作用。目前对骨骼肌线粒体自噬的了解程度还处于较低水准，作为新发现的线粒体自噬受体蛋白，FUNDC1因在缺氧条件下发挥其重要作用而越来越受到关注，但目前对于FUNDC1在运动诱导的骨骼肌线粒体自噬中作用的研究仍不充分。运动诱导的骨骼肌线粒体自噬可能通过AMPK-ULK1信号通路影响FUNDC1表达，今后有关骨骼肌线粒体自噬的研究可注重FUNDC1与能量代谢之间的关系，从而为探究运动能否通过线粒体自噬途径对机体的疾病治疗起到辅助作用提供依据。