基于改良型痘苗病毒安卡拉株载体的新型流感疫苗研究进展

尹 元，王伟灵

基于改良型痘苗病毒安卡拉株载体的新型流感疫苗研究进展

尹 元，王伟灵

流感是由流感病毒引起的一种严重危害公众健康的呼吸道传染病，已引起全球的高度关注，接种疫苗是预防流感最有效的措施。当前，建立快速流感疫苗研发生产平台对于流感的预防与控制至关重要。以病毒为载体的活疫苗为感染性疾病的防控提供了新的手段。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara, MVA)是一种复制缺陷型病毒载体。MVA能够同时容纳并表达多个外源抗原、诱导较好的体液和细胞免疫应答并具备良好的安全性，具有成为理想疫苗载体的潜力。本文就MVA载体在流感疫苗研究中的应用做一综述。

流感病毒；改良型痘苗病毒安卡拉株；病毒载体疫苗

流感是由流感病毒(influenza virus)引起的一种严重危害人类健康的急性呼吸道传染病。据估计每年季节性流感的流行造成全球200万～500万重症病例，引起约25万～50万人死亡[1]。自二十世纪以来4次的流感大流行给人类带来了巨大损失。1918-1919年H1N1亚型引起西班牙大流感共导致全球约5000万人死亡[2]。1957年由H2N2亚型引起亚洲流感及1968年H3N2亚型引起香港流感造成约50万～200万人死亡[3]。2009年，墨西哥流感在短短几个月时间内就蔓延至全球200多个国家和地区，共导致约18 000人死亡[4]。2013年3月在我国华东地区出现由基因重配产生的感染人类的新型H7N9禽流感病例[5]。截至2017年1月16日，全球共报告918例人感染H7N9禽流感病毒实验室确诊病例，其中死亡359例，病死率39%[6]。

接种疫苗仍然是目前为止预防和控制流感流行最有效手段[7]。当前使用的流感疫苗主要有3种，分别为灭活疫苗，减毒活疫苗与重组亚单位疫苗[8]。近年来细胞基质疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗及病毒载体疫苗已成为新型流感疫苗的研究热点领域。病毒载体疫苗是指以病毒作为载体，将目的基因重组到病毒基因组中，使用能表达目的抗原基因的重组病毒制成的疫苗。病毒载体疫苗能够模仿病原体自然感染的方式进入机体，在体内表达目标抗原并激发全面、有效、持久的免疫应答，是理想疫苗的设计形式之一。目前应用于流感的病毒载体疫苗主要包括腺病毒，腺相关病毒、痘病毒、甲病毒、杆状病毒、新城疫病毒、副流感病毒及疱疹性口炎病毒等[9]。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara, MVA )作为痘病毒的一种，已经广泛应用在新型流感疫苗研究中，本文将就MVA作为流感病毒载体疫苗进行综述。

1 MVA及其作为活病毒疫苗载体的概况

痘苗病毒是痘病毒家族成员，是目前为止结构较为复杂的DNA病毒，含有一条双链DNA和一个大约300 nm×240 nm×120 nm的外被。与其他DNA病毒不同的是其只在宿主细胞浆中复制，并不依赖宿主细胞基因组，也不会整合进宿主细胞基因组，具有较高的安全性[10]。人类在使用牛痘病毒消灭了天花之后，就尝试将其作为一种新的载体用于其他疫苗的呈递。改良型痘苗病毒安卡拉株的亲本病毒最早源自马的痘病变部位分离，经驴皮肤划痕传代，后经德国Anton Mayr领导的研究小组在鸡胚成纤维细胞传代超过570次获得[11]。自1968年至1988年德国巴伐利亚国家疫苗研究所一直将MVA作为人天花病毒疫苗使用，在此期间，超过12 000人接种MVA疫苗，大量的研究已经证实MVA作为天花疫苗良好的安全性[12]。

2 MVA载体在新型流感疫苗研究中的应用

2.1 基于MVA载体的H5N1流感疫苗研究 H5N1高致病性禽流感病毒自1996年在我国广东省首次分离以来，已经陆续在亚洲、欧洲、非洲的家禽与野鸟中发现。传统季节性流感疫苗生产技术难以及时提供足够高效的H5N1禽流感疫苗。一种新毒株出现后至少需4个月方可研发出首剂疫苗，由于H5N1病毒对人的高致病性，其疫苗生产需在生物安全三级实验室进行，另外H5N1病毒对鸡胚的致死性导致其在鸡胚中的产量极低[13]。目前的研究表明H5N1灭活疫苗在人体中诱导的免疫反应较低，需要使用高剂量抗原、增加免疫次数或使用佐剂才能提供足够的保护[14]。由于HA抗原易漂移，而不同分支H5N1毒株在禽类中同时流行，因此有效H5N1流感疫苗须能够对来自不同分支的H5N1具有交叉反应性。

Jutta等[15]发现源于A/Vietnam/1194/04 (H5N1)HA的重组MVA-H5疫苗在小鼠抵抗同源病毒A/duck/Vietnam/TG24-01/05攻击时能够提供较好的保护作用。荷兰伊拉斯谟医学中心的A Hessel等对MVA载体的H5N1重组疫苗进行了多项研究，其构建了来自不同分支H5N1的A/Hongkong/156/97和A/Vietnam/1194/04的HA的重组疫苗，并分别用同源和异源A/HK/156/97、A/VN/1194/04、A/Indonesia/5/05病毒攻毒，两种疫苗均能为小鼠提供保护，而MVA-HA-VN/04能提供更好的保护[16]。随后他们在哺乳动物食蟹猴中对重组疫苗的保护性进行研究，结果显示3×108pfu MVA-HA-VN/04免疫两次后，使用同源A/VN/1194/04和异源A/Indonesia/5/05毒株攻毒，疫苗均能提供保护[17-18]。在对剂量和免疫次数的研究中发现采用肌注105pfu重组疫苗免疫1次或104pfu免疫2次即能对小鼠提供抵抗同源A/VN/1194/04病毒攻击的保护，106pfu免疫1次或104pfu免疫2次能对小鼠提供抵抗异源A/Indonesia/5/05病毒攻击的保护[19]。此外基于MVA载体的H5N1重组病毒载体疫苗MVA-H5-sfMR已经完成了在人群的I期、IIa期临床试验，结果表明疫苗安全性良好，并诱导了高滴度的特异性抗体[20]。

病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)疫苗是由病毒的一种或多种结构蛋白自行装配而成的类似病毒粒子完整结构的颗粒。病毒样颗粒由于缺少病原体遗传物质，不能自主复制也不具有感染性，因而具有良好的安全性，同时在形态结构上与原始病毒颗粒类似，具有很好的免疫原性。Falko等[21]将流感病毒H5N1 HA基因克隆入MVA载体构建重组MVA-HA，通过哺乳动物细胞(Vero细胞)即能进行蛋白表达组装成VLP，而若MVA-NA(H5N1)与其同时表达则能够显著提高VLP的产量。利用MVA-HA/NA在鸡胚成纤维细胞表达的VLP免疫小鼠显示出了良好的免疫原性，攻毒试验中能够对小鼠提供对同源和异源流感病毒的保护。目前已经报道有多种表达系统应用于病毒样颗粒疫苗的生产，使用较为普遍的是杆状病毒-昆虫细胞表达系统，而该研究中利用哺乳动物细胞生产VLP疫苗相较昆虫细胞表达系统优势主要表现在昆虫细胞不能在翻译后修饰中将唾液酸结合到N-糖链上。

2014年Kamlangdee等[22]通过一种遗传算法将2 145株不同来源的H5N1 HA序列设计出一个能够最大程度覆盖所有毒株CD8+T细胞表位的Mosaic-H5序列，并克隆入MVA载体构建重组载体疫苗MVA-H5M，用单剂量107pfu疫苗免疫小鼠即能对小鼠提供抵抗100 LD50的多株clade 0, 1, and 2的H5N1病毒攻击的保护，同时也能够对小鼠提供对异亚型A/Puerto Rico/8/34(H1N1)攻击的保护，此外研究者对该疫苗的长期保护性研究结果表明疫苗免疫后5个月小鼠体内仍然存在较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。进一步的研究结果表明MVA-H5M诱导更高水平更广谱的H5特异的B细胞和T细胞免疫应答，MVA-H5M诱导的较强CD8+T细胞应答在抵抗异亚型PR8攻毒中发挥了关键作用[23]。

2.2 基于 MVA载体的H1N1流感疫苗研究 Joost等[24]将来自A/California/04/2009(H1N1) HA克隆入MVA载体构建重组疫苗MVA-HA-Ca/09，并在雪貂中使用异源的A/Netherlands/602/2009(H1N1)感染动物对其免疫原性与保护性进行评价。结果显示，疫苗免疫一次后雪貂只能产生有限的中和抗体，对抑制病毒在肺部和呼吸道的复制所起作用有限，而免疫两次后即能提供较理想的保护。Annett等[25]将来自A/California/7/2009(H1N1)的HA、NA基因分别插入MVA载体构建重组疫苗MVA-H1-Ca、MVA-N1-Ca，疫苗在小鼠体内诱导了特异的中和抗体及分泌IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞，MVA-H1-Ca 107pfu两次免疫能够对小鼠提供完全保护，而MVA-N1-Ca只能提供部分保护，采用MVA-H1-Ca免疫后血清过继免疫重度联合免疫缺陷小鼠，攻毒后也能提供保护。Maria等[26]构建基于A/California/7/09 (CA/09)HA的MVA-HA-Ca重组疫苗，免疫小鼠后用不同来源H1N1毒株攻毒，结果显示出一定的交叉反应性，能向小鼠提供抵抗部分毒株的保护作用。

2.3 基于MVA载体的H7N9流感疫苗研究 2013年春，我国华东地区暴发了人感染H7N9禽流感病毒疫情，造成了大量的死亡病例[6]。进入2017年，国家卫计委最新公布数据显示，1月份我国发生人感染H7N9禽流感192例，其中死亡79例[27]。早前的研究表明传统技术生产的H5N1和H7N9亚型流感疫苗免疫原性较低，需要使用佐剂或增加剂次才能达到理想的免疫应答，然而佐剂的使用有较多的限制和副反应[28]。MVA作为新型疫苗载体已经多次在H5N1重组病毒载体疫苗上的应用，并诱导了较好的免疫应答。Joost等[29]将A/Shanghai/2/2013(H7N9)HA基因进行密码子优化后克隆入MVA载体构建重组H7N9疫苗MVA-H7-Sh2，并在雪貂中对其免疫原性和保护性进行评价。结果显示用108pfu MVA-H7-Sh2采取肌注方式免疫雪貂，免疫一次后92%的雪貂能够达到血清学转换，75%的雪貂产生血清学保护；免疫两次后实验组所有雪貂均能达到血清学保护。使用异源A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒感染雪貂，实验组疫苗能够对雪貂提供抵抗病毒攻击的保护效果。MVA作为活病毒载体疫苗在不需获得毒株情况下，通过已公布的病毒核酸序列能在短时间内快速进行疫苗研发和生产，为疫苗提早上市争取宝贵时间，在突发流感疫情暴发时显得尤为关键。

3 基于MVA载体的流感通用疫苗研究

3.1 基于MVA载体与NP、M1联合表达的流感疫苗研究 NP和M1具有型特异性，是流感病毒的分型的重要依据，在甲型流感病毒中高度保守，其中NP的最大变异不超过11%，M1最大变异不超过5%，因此也成为近年来流感通用疫苗研究的主要靶点[30-31]。在小鼠模型和人群中的研究均表明NP蛋白主要诱导产生交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞进而促进病毒的清除[32]。针对NP特异的非中和抗体在流感病毒感染中所发挥的作用一直存在争议，目前发现其可能通过抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)等途径在病毒清除中发挥作用[33]。基于M1和NP的重组MVA载体疫苗MVA-NP+M已经取得了较大进展，目前已经公布了临床I期与IIa期试验结果。结果显示肌注免疫后一周即能诱导高水平特异的T细胞应答[34]，在感染实验中免疫后一周即能提供保护[35]。同时临床试验中研究者对健康成人、18～45岁成人及>60岁老年人分别进行安全性评价，结果显示疫苗在人群的使用是安全的[36]。对不同免疫策略的比较研究表明使用腺病毒载体表达的Ad-NP+M1初免后用MVA-NP+M1加强免疫较单独使用一种载体诱导了更高水平的T细胞反应，其中采取腺病毒载体肌注后MVA载体滴鼻或肌注诱导了增强的高水平T细胞应答[37-39]。

有报道曾将MVA联合乙型肝炎病毒蛋白抗原免疫小鼠，能够显著增强蛋白抗原诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答[40]。研究者分别在小鼠、鸡和猪三种动物模型中使用重组MVA-NP+M1病毒载体疫苗与重组HA蛋白疫苗联合免疫，结果表明联合免疫组能够明显增强HA特异性中和抗体和特异性T细胞免疫应答，同时发现MVA可能通过提高小鼠引流淋巴结生发中心B细胞比例进而增强B细胞功能[41]。在人群中采用重组MVA-NP+M1病毒载体疫苗与三价季节性流感疫苗联合免疫策略对MVA重组病毒载体佐剂效应进行研究，结果显示实验组联合免疫虽然并未增加分泌IFN-γ的T细胞数量，但明显提高了疫苗特异的抗体水平[42]。此外也有研究表明MVA能够通过上调共刺激分子CD80，CD83和CD86表达以及降低TNF-α，IL-6的水平进而诱导DC细胞的成熟[43]。MVA-NP+M1在临床试验中显示出了良好的安全性，同时也诱导产生理想的细胞免疫反应，有望成为一款理想的基于病毒载体的通用疫苗。

3.2 基于MVA载体与HA、NP联合表达的流感疫苗研究 体液免疫与细胞免疫在流感病毒感染中共同发挥重要作用，为了使一剂疫苗同时诱导特异性中和抗体与T细胞免疫应答，多个研究小组同时将流感病毒表面蛋白HA与内部蛋白NP插入MVA载体构建重组疫苗。早在90年代初，Sutter等[44]将来自A/PR/8/34的HA和NP与MVA构建重组MVA-HA-NP病毒载体疫苗，在小鼠实验中均诱导产生了针对HA的特异性抗体和NP的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)，并能对小鼠提供抵抗同源PR8病毒致死量攻击。Bradley等[45]构建的MVA-HA-NP重组疫苗采取灌胃方式免疫小鼠，诱导产生了特异的粘膜IgA，血清IgG及特异CTL反应，并能够提供小鼠抵抗同源和异源亚型病毒攻击保护。此外Joseph N等[46]构建了分别来自A/California/04/2009(H1N1pdm)HA和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)NP的MVA-HA-NP重组疫苗，动物实验结果显示该疫苗对小鼠提供抵抗致死量H1N1pdm，PR8及H5N1攻击的完全保护，并对H3N2病毒攻击提供部分保护。在食蟹猴模型中，MVA-HA-NP(H5N1)能够显著降低动物排出的病毒滴度，而ADCC可能在该交叉保护中发挥重要作用[47]。

3.3 基于MVA载体与多抗原组合表达的流感疫苗研究 当前使用的疫苗主要由流感病毒的两种表面蛋白组成只能对与其抗原性一致或相似的毒株提供保护。Hessel等[48]构建了基于MVA载体和多个流感病毒保守抗原的重组疫苗并对其保护性进行研究。他们分别将NP、PB1、M1、M2、HA-Stalk，HA-Stalk+NP，HA-Stalk联合来自H5N1，H9N2，H7N2和H1N1的4个M2e串联及HA-Stalk+4×M2e+NP的MVA重组疫苗。以106pfu重组疫苗肌注免疫小鼠两次，间隔三周，随后分别用致死量H5N1，H9N2，H7N1感染小鼠，结果显示所有含有NP片段的重组疫苗，MVA-NP，MVA-HA-Stalk+NP，MVA+HA-Stalk+4×M2e+NP均诱导了较好的免疫应答，能够提供小鼠抵抗同源和异源病毒攻击的保护，这可能与NP诱导产生的特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞有关。而其他各组MVA-HA-stalk，MVA-HA-stalk+M2e，MVA-M1，MVA-M2，MVA-PB1均未诱导保护性免疫。此外他们发现表达NP的MVA重组疫苗能够增强对体内存留的对早前流感感染的免疫应答。

4 小结与展望

目前MVA重组活载体疫苗已经在包括结核、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、副流感病毒等重要病原体新型疫苗研究中取得可喜的进展。MVA作为一种新型疫苗生产平台能够快速应对新发传染病。以MVA作为疫苗载体具有诸多优势：①能够同时容纳多个大片段基因，并有效表达外源基因，表达具有原始构象的抗原蛋白；②MVA自身具有复杂的结构，包含大量的外壳蛋白和酶，能够同时诱导针对多种抗原的免疫反应，从而使自身也具有很好的免疫原性，载体本身也具备很好的佐剂功能，从而能够辅助外源基因的表达产物在体内诱导更为强烈的免疫应答；③MVA病毒属于非复制型病毒，对宿主具有很好的限制性，只能在鸡成纤维细胞中快速繁殖，在哺乳动物细胞内不会复制且不会出现返祖的致病现象，作为疫苗载体具有良好的安全性。此外，MVA载体疫苗产生的针对载体自身的预先免疫反应较其他病毒载体疫苗如腺病毒载体也有限。综上，MVA重组活载体流感疫苗将为流感疫苗的研究提供一种新的策略。

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Advance in the development of modified vaccinia virus Ankara (MVA) vectors for novel influenza vaccines

YIN Yuan, WANG Wei-ling

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiTCM-integratedHospital,Shanghai200082,China)

Influenza, caused by influenza virus, is a respiratory infectious disease with a serious hazard to human health. Prevention of influenza through vaccine development is the most effective strategy. It is important to build a rapid response platform for research and production of influenza vaccine. As virus vectors, live vaccine provides a new prevention and treatment way for infectious disease. Modified vaccinia virus Ankara(MVA) is a replication-deficient viral vector that is safe and can encode one or more foreign antigens and induce humoral and cellular immune response. MVA holds great promise as a vaccine platform. In this review, we discuss the use of MVA for vaccine development against influenza virus.

influenza virus; modified vaccinia virus Ankara; viral vector vaccine

Wang Wei-ling, Email: wangweiling888@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.006

上海中医药大学中西医结合一流学科创新基金项目资助

王伟灵，Email: wangweiling888@126.com

上海中医药大学附属上海市中西医结合医院检验科，上海 200082

R373.1

A

1002-2694(2017)03-0222-06

2016-12-15 编辑：林丹

Supported by the Innovation Fund Project of the First-class Discipline for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Shanghai University of Traditional Chinese Medicine