猪弓形虫病最新检测方法研究概况

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪弓形虫病最新检测方法研究概况

庄金秋，梅建国，张 颖，杨丽梅，李 峰，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

弓形虫病是一种人兽共患寄生虫病。本文综述了猪弓形虫病的最新实验室检测方法研究情况，如病原学检测方法、血清学检测方法（包括凝集试验和ELISA）和分子生物学检测方法（包括PCR、荧光定量PCR、PCR-RFLP、原位PCR、免疫-PCR、环介导等温扩增法和核度探针技术）等，阐述了不同检测方法的检测效果和优缺点，以期为猪弓形虫病的检测与防控提供参考。

弓形虫；猪弓形虫病；检测方法；研究进展

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人兽共患原虫病。该病主要引起孕妇流产、产弱胎、畸胎、死胎以及儿童生长发育受阻、死亡。在家畜中，弓形虫病主要感染猪，以高热、呼吸困难、神经症状以及繁殖障碍为特征。据了解，我国养猪场中曾大规模暴发弓形虫病，死亡率高达60%，给畜牧业生产造成了极大的经济损失。据近年来的弓形虫病血清学调查结果显示，猪弓形虫病感染率较高，且呈逐年上升趋势。猪弓形虫病严重威胁着动物健康和人类公共卫生安全，因此实时监测猪群弓形虫感染对于防控该病尤为重要。由于猪多表现为隐性感染，其临床症状和病理变化与猪瘟相似，因此需要进行实验室检测才能确诊。本文综述了近年来猪弓形虫病实验室检测方法研究进展，以期为科研工作者和广大养猪业主更好地防治该病提供参考。

1 病原学检测方法

病原学检测方法包括直接涂片染色或组织切片染色观察法、动物接种或细胞培养法、卵囊检查法等。该方法是查验弓形虫最可靠的方法，缺点是敏感性低、耗时长、容易漏诊[1]。

2 血清学检测方法

2.1 凝集试验

主要包括直接凝集试验（DAT）、间接血凝试验（IHAT）、乳胶凝集试验（LAT）以及改良凝集试验（MAT）。IHAT主要用于大规模的流行病学调查，Senet等[2]证实了IHAT检测IgM抗体更敏感，且比间接免疫荧光试验（IFAT）更能检测低滴度弓形虫抗体。王天奇等[3]、王海燕等[4]先后以IHAT方法调查河南洛阳地区猪弓形虫感染情况，发现该地区猪弓形虫感染有明显上升趋势。罗才庆等[5]应用酶联免疫吸附试验（ELISA）和IHAT方法，平行检测来自福建龙岩市某猪场的32份猪血清中抗弓形虫特异性抗体，结果显示ELISA和IHAT方法对猪弓形虫的抗体阳性检出率分别为62.5%（20/32）和53.13%（17/32）。王贝贝等[6]发现MAT方法适用于对初筛样本以及临床疑似弓形虫感染个体的筛查，但该法费时费力，不宜在基层推广使用。Lorry等[7]认为MAT方法可用于畜群血清学检测，且该法可作为检测组织液的良好候选法。

2.2 ELISA

ELISA是国内外多数实验室检测弓形虫抗体的最常用方法。管刚等[8]用弓形虫的重组蛋白P30作为抗原建立了ELISA方法，对青海省互助县的139份猪血清抗体进行猪弓形虫病检测，阳性率为5.76%，应用IHAT方法检出的阳性率为13.67%，ELISA检测的阳性率明显低于IHAT检出的阳性率。江涛等[9]应用弓形虫重组微线体蛋白3（rMIC3）作为包被抗原建立了间接ELISA方法，以ELISA与LAT平行检测471份猪血清样本，弓形虫抗体阳性检出率分别为39.49%和44.16%，二者总符合率为92.56%。罗才庆等[5]对ELISA和IHAT比较发现，ELISA更适用于猪弓形虫抗体检测。杨亚晓等[10]比较金标法、IHAT和ELISA发现，ELISA检测弓形虫IgG抗体的敏感性和特异性较高，适合于大规模的弓形虫IgG抗体筛查。丁邦胜等[11]建立了3种重组抗原（rSAG1 + rHXGPRT + rAK）混合的间接ELISA方法，检测弓形虫IgM和IgG。Bartomiej等[12]使用5组弓形虫重组嵌合抗原建立ELISA方法，检测马、猪、羊3种家畜动物血清中的IgG，结果显示所有嵌合抗原具有高特异性（100%）。许正茂等[13]以弓形虫TgSAG2蛋白作为包被抗原，对新疆巴州地区433份猪血清样品进行了ELISA检测，平均阳性率为12.70%（55/433），其中，散养猪场阳性率为16.83%（35/208），规模化养殖场为9.94%（16/161），散养猪场阳性检出率显著高于规模化养殖场。邵晓冬等[14]采集河南洛阳地区规模化养殖场和散养户母猪、育肥猪、保育猪血清样品410份，应用ELISA方法检测抗弓形虫IgG抗体，结果发现猪弓形虫血清抗体阳性率达35.4%，母猪、育肥猪和保育猪的阳性率分别是50.4%、34.5%和22.2%，规模养殖场母猪及育肥猪阳性率极显著或显著低于散养户。目前，市场上的各种猪弓形虫病ELISA诊断试剂盒质量参差不齐，进口试剂盒与国产试剂盒的符合率、敏感性和特异性都存在较大差距。何勇等[15]、白昀等[16]先后比较国内外ELISA商品化试剂盒后提出，选用临床试剂盒时可从性价比方面考虑，选用质优价廉的国产试剂盒，不必完全依赖进口试剂盒，但在确有必要引进国外试剂盒时，也应选用质量稳定可靠的产品。

3 分子生物学检测方法

3.1 聚合酶链式反应（PCR）

目前，根据研究者选择弓形虫基因组中拷贝数和保守型的不同，PCR检测技术的灵敏度和特异性也有所不同，常作为弓形虫检测的基因主要有：200～300个拷贝的529 bp重复序列，基于35个拷贝数的B1基因、P30基因，以及核糖体第一内转录间隔区（ITS-1序列）等。

Homan等[17]从弓形虫基因组中鉴定出200～300个拷贝的529 bp DNA片段，可作为遗传标记，用于弓形虫与其他寄生虫的种间鉴定。宋慧群等[18]对我国不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株及国际标准强毒株（RH株），在529 bp重复序列的变异进行研究，进一步证实了该DNA片段可用于种间鉴定。Edvinsson等[19]针对529 bp重复序列181～274 bp位设计引物，检测下限约为1个弓形虫速殖子。Opsteegh等[20]针对529 bp重复序列243～405 bp位设计引物，检测下限约0.14个速殖子。赵东岳等[21]针对529 bp重复序列178～376 bp位设计引物，最低检出限仅为173个拷贝。候照峰等[22]针对529 bp重复序列268～359 bp位设计引物，检测下限10个拷贝，约0.03～0.05个速殖子。

B1基因是从弓形虫RH株基因组文库中克隆筛选的1个2.2 kb的片段，它是在整个基因组中有35个拷贝的串联重复片段。Hoyen等[23]应用B1基因设计合成引物，成功建立了巢式PCR方法用于检测病人血液样品中的弓形虫。王海燕等[4]以B1基因作为弓形虫种特异的遗传标记，建立诊断弓形虫病特异性的PCR方法，最低能检测到10个弓形虫速殖子DNA。P30基因为编码弓形虫速殖子表膜蛋白。Sawa等[24]首先应用P30基因设计引物进行PCR检测，发现对所检测的7株弓形虫株都能扩增，且对任何其他寄生虫与微生物都未见扩增。崔平等[25]以P30基因设计引物建立的PCR方法，最低能检测到5个弓形虫速殖子的DNA。孔得翔等[26]以P30基因设计了3条特异性引物，建立了半巢式PCR方法，最低检测的DNA含量为18 fg。

ITS序列是各物种间相对较为保守的序列，已成为在序列水平上探讨科内、属间及种间遗传关系的有效手段。Homan等[27]证实ITS-1可作为分子标记物，用于弓形虫与其他原虫的种间鉴定。Jauregui等[28]根据弓形虫ITS-1序列设计引物建立PCR，敏感性最少可检100 fgDNA，相当于1个虫体的DNA含量。谢德华等[29]以ITS-1序列作为弓形虫种特异性的遗传标记，建立了PCR方法。廖申权等[30]应用该法对2例猪弓形虫病进行了特异诊断。邵国青等[31]以弓形虫ITS-1序列为遗传标记建立PCR，最低可以检测1 pg弓形虫速殖子DNA，相当于10个速殖子的DNA。黄翠琴等[32]分别以弓形虫ITS-1序列和529 bp重复序列为目的片段，对疑似猪弓形虫病的病料进行PCR诊断。

弓形虫微线体蛋白MIC是分布于虫体前端棒状体周围的微线体所分泌的粘附因子。MIC3在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达，在弓形虫病的早期诊断中具有重要价值。任科研等[33]以MIC3基因作为弓形虫特异的遗传标记，建立了PCR方法，为弓形虫基因重组疫苗奠定了基础。

3.2 荧光定量PCR

王频佳等[34]、Lin等[35]先后建立了以弓形虫高度保守的529 bp重复序列作为检测靶基因的荧光定量PCR。候照峰等[22]以529 bp重复序列作为靶基因建立了荧光定量PCR方法，检测的69个组织样品中，荧光定量PCR方法的检出率（50.7%）明显高于常规PCR方法的检出率（34.8%）。朱祥明等[36]建立了以B1基因作为检测靶基因的弓形虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。Edvinsson等[19]分别以529 bp重复序列和B1基因为靶基因建立荧光定量PCR方法，发现529 bp的灵敏性是B1基因的10倍。Menotii等[37]根据529 bp序列设计Taq Man-AF-PCR检测方法，与B1-PCRELISA检测方法相比，144份临床样本中，B1-PCR-ELISA检测出的72份阴性样本，经过Taq Man-AF-PCR检测出15份（20.8%）为阳性，且可提前4～10 d检测到病原。赵东岳等[38]以529 bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为检测的靶基因，建立检测弓形虫的三重SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，并与ELISA进行比较，阳性符合率为53.44%（P<0.01），表明建立的三重SYBR Green I荧光定量PCR具有高特异性和敏感性，可为临床弓形虫的诊断提供科学依据。

3.3 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）

谢德华等[39]通过对我国不同来源、不同宿主的4个弓形虫虫株以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原（GRA6）基因进行PCR-RFLP分析，结果证明弓形虫包含了I和II基因型。Su等[40]利用10个基因标记物建立了多重多位点巢式PCRRFLP进行基因分型。Zhou等[41]从来自我国湖北省、河南省的434头病猪中分离出16个弓形虫虫株，用PCR-RFLP方法也鉴定出2个基因型。

3.4 原位PCR（In Situ PCR，IS-PCR）

卢慎[42]应用免疫组化、原位杂交及间接原位PCR技术，检测组织细胞中的弓形虫，结果表明弓形虫检测结果阳性率从高到低依次为间接原位PCR、原位杂交及免疫组化。

3.5 免疫-PCR（I-PCR）

李辉等[43]建立免疫-PCR检测弓形虫抗原最低浓度为0.1 ng/mL，I-PCR检测弓形虫抗原灵敏度高于传统ELISA检测6 000倍，高于ABCELISA 750倍。

3.6 环介导等温扩增法（LAMP）

邹杰等[44]建立的弓形虫LAMP法能够检测出10个拷贝的目的基因。余传信等[45]依据弓形虫的B1基因设计引物建立LAMP方法，其敏感性是常规PCR的10倍。Sotiriadou等[46]分别以LAMP和套式PCR方法对26个弓形虫的阳性水样进行检测分析，结果LAMP的检出率为100%，而套式PCR的检出率为53.8%。Zhang等[47]根据弓形虫529 bp重复序列设计引物，对疑似弓形虫感染的猪分别以常规PCR方法和已建立的LAMP方法检测其淋巴结样本，结果LAMP检测的阳性率为85.7%，而常规PCR检测的阳性率为76.9%。曹利利等[48]在建立LAMP方法的基础上，对吉林省部分地区的423份猪血液样本进行了猪弓形虫病检测，阳性率为7.8%（33/423），表明该地区仍是猪弓形虫病的流行地区。

4 小结

猪弓形虫感染途径多、传播方式广，且目前尚无特效治疗药物和方法。因此，加强养殖环节对该病的预防控制，提高猪产品中弓形虫检测技术水平，对减少其对养猪业的危害、降低其通过猪产品而致人感染的风险性，具有极其重要的意义。目前，猪弓形虫病检测方法很多，其中以病原学方法结果最为可靠，但其敏感性低，且费时费力。常规的免疫学方法虽具有简易、快速等优点，但对于阳性结果的分析要慎重。以PCR为代表的分子生物学方法具有敏感、特异、检测迅速等优点，能直接反应现症感染，但存在假阳性、操作繁琐、需专用仪器等缺点。因此，在实际中应按照国家或行业标准，根据业主生产环节及加强防疫卫生的需要，选择弓形虫病检测方法和配套试剂，以满足生产管理和公共卫生需求，使猪弓形虫病检测方法得到更快、更好的发展。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress on Detection Methods of Swine Toxoplasmosis

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Yang Limei，Li Feng，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Toxoplasmosis is a zoonotic parasitic disease. The research progress on the latest detection methods of Swine Toxoplasmosis were introduced in this paper，inluding the pathogenic serological detection methods，detection methods（including agglutination test and ELISA），molecular biological detection methods（including PCR，PCR，PCR-RFLP，fluorescence quantitative PCR，in situ immune -PCR，loop mediated isothermal amplification of probe and nuclear technology）and so on. The advantages and disadvantages of different detection methods were analyzed，in order to provide reference for the detection and prevention of Swine Toxoplasmosis

Toxoplasma gondii；swine toxoplasmosis；detection method；research advance

S855.9+9

：B

：1005-944X（2017）06-0063-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.020

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）