蜜蜂基因功能验证技术研究进展

庞倩 张文文 王康 吉挺

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

蜜蜂基因功能验证技术研究进展

庞倩 张文文 王康 吉挺

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

蜜蜂是研究社会性行为、生态学以及神经生物学的模式动物，开展相关功能基因研究具有重要的意义。然而鉴于蜜蜂的社会性及清洁行为等特征，其有关功能基因验证的研究进展缓慢。本文对转基因技术、RNA干扰技术及CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术在蜜蜂功能基因验证方面的研究成果进行综述，并对蜜蜂功能基因研究的前景进行展望，以期为蜜蜂相关研究提供依据。

蜜蜂；基因功能；验证技术

蜜蜂作为重要的经济传粉昆虫，对农业生产起着至关重要的作用，具有巨大的生态价值。蜜蜂以群体为单位的社会性行为，严格的等级制度以及学习记忆等特性，使其成为社会行为学、生态学以及神经生物学研究的模式动物[1]，具有重要的研究意义。蜜蜂作为模式动物，其研究优势主要有：（1）典型的社会性昆虫，具有精确而复杂的社会性结构；（2）生长周期短；（3）蜂王繁殖力高，据统计，意大利蜜蜂的蜂王一天最多可产2000粒卵；（4）拥有完整的基因组信息。但是，蜜蜂的社会性使其在模式动物方面的研究受到一定的限制[2]，蜜蜂功能基因的研究也相对比较落后。随着生物技术的进步与发展，基因组的研究已经成为遗传育种热点研究之一[3]，加强并完善蜜蜂基因功能的研究，进一步阐明其中的分子机理，有助于更好的阐释蜜蜂的行为特征，从而为蜜蜂的遗传改良、抗病育种提供有利的基因。

随着意大利蜜蜂全基因组测序的完成，大量未知功能的基因等待挖掘，而验证基因组中这些基因的功能、基因的表达调控以及基因间的相互关系等是一项艰巨的任务。生物信息学虽然能够预测基因的功能，但是具有局限性，而且基因功能的研究最终仍需要实验来验证。蜜蜂虽具有悠久的饲养历史，但有关其功能基因验证的研究比较少。现在，功能基因研究的技术主要有转基因技术、RNA干扰技术、基因编辑技术等。本文就功能基因的验证技术做一综述，旨在为蜜蜂基因功能的研究提供思路。

1 转基因技术

转基因最初应用于基因功能的研究，即把外源基因导入受体基因组内，通过观察生物体表现出来的性状，达到揭示基因功能的目的。有关蜜蜂转基因的研究早在30几年前就已经开始，但并没有大的突破[4]。动物转基因技术主要有显微注射法、精子介导法、电穿孔法、转座子载体法、病毒转染法等。

1.1 精子介导法

用精子作为转移外源DNA的载体最早由Brackett等[5]提出。1991年，Atkinson等[6]首次证实了蜜蜂的精子能够吸收外源DNA。2000年，Robinson等[7]证实了蜜蜂精子能够将外源DNA携带进入卵子，数月之后，仍能在受体蜜蜂中检测到外源DNA，并且可以稳定遗传给下一代，证实了精子介导法在蜜蜂上的可行性。郭冬生等[8]通过精子介导法以及人工授精技术将线性化的pGFP-2质粒导入处女王，成功获得了带有绿色荧光的后代，得到克隆转基因蜜蜂。该研究为利用精子介导法使外源基因在蜜蜂体内表达提供了理论支持，同时，为蜜蜂基因功能的验证做出了探索。

利用精子能够吸收外源DNA的能力，将其作为载体，然后结合人工授精技术将外源DNA导入到胚胎中，这一方法具有简单、易操作、成功率高等优点，但是，外源DNA在蜂王的受精囊内有被降解的风险，所以，为降低外源DNA的降解率，提高成功率，在人工授精之后应尽量缩短蜂王开始产卵的时间。

1.2 电穿孔法

活体电穿孔法是指通过电场作用，将外源基因导入目标组织或器官。其原理是细胞膜表面在直流电场作用的瞬间会产生疏水或亲水的微小通道，这种通道能维持几毫秒到几秒，在此期间生物大分子可通过这种微小的通道进入细胞，而后通道自行恢复[9]。

2004年，Kunieda and Kubo[10]建立了蜜蜂电穿孔法转基因体系，RT-PCR和免疫印迹分析证明导入的外源基因在蜜蜂大脑中获得表达。郭冬生等[11]通过电穿孔法成功将外源基因EGFP导入中华蜜蜂的卵内，并且检测到EGFP基因的表达，其阳性表达率达到1.05%。该两项研究为利用电穿孔法研究基因功能做出了有益探索，并为蜜蜂功能基因的研究提供了技术参考，奠定了理论基础。

近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道逐渐增多，在基因治疗方面的优势也日渐明显，是一种有效的活体基因导入方法[12]。首先，电穿孔法可在多种组织器官上应用，且效率较高[13]。其次，对导入的外源基因片段的大小没有限制[14]。此外活体电穿孔法操作简单快速，电穿孔的时间只有几秒钟，并且DNA片段不需要特殊的纯化操作。但是电穿孔法也存在一些缺点，如：电压过低，则外源基因无法进入细胞；电压过高会增加对机体的损伤，甚至造成外源基因的无法表达。另外，在操作过程中还可能对活体造成污染。由于蜜蜂的清洁行为，经过电转处理的卵或者幼虫的饲养也是需要解决的问题，所以电穿孔技术还需要进一步的优化。

分析发现，近几年利用精子介导法或者电穿孔法做蜜蜂转基因的相关研究较少，究其原因，除了技术本身的缺陷，主要是因为蜜蜂工蜂的清洁行为，哺育蜂清洁巢房时，会清理掉有异味或者受损的等不正常的卵和幼虫。而对蜜蜂的幼虫或者卵进行转基因操作时肯定会对幼虫或者卵造成损伤或者使幼虫或者卵携带异味，当把处理过的幼虫或者卵放回蜂群哺育时，这些幼虫或者卵就会被清理掉，导致实验的失败。而蜜蜂是以群体为单位的社会性昆虫，若由人工孵育幼虫或者卵，则失去了实验的说服性和意义。其次是雌性蜜蜂具有级型分化现象，如何使经过转基因操作的卵或者幼虫发育为蜂王，并且将遗传信息高效稳定的遗传给后代也是阻碍蜜蜂转基因技术发展的另一主要原因。

近年来，随着技术的发展和研究的深入，研究人员将对蜜蜂转基因的研究转移到转座子piggyBac的利用上。2014年，Schulte等[15]构建piggyBac转座子转基因载体，然后给0～1.5 h的卵注射转基因载体和转座酶mRNA，注射后的卵于34℃孵化72 h后移入有王浆的王台，10天后将王台移入王笼，羽化后的处女王由哺育蜂哺育，在飞行房中交尾。该实验表明piggyBac载体能够有效的将表达组件导入蜂王基因组，并且可以稳定高效的在子代中表达。这一研究结果为蜜蜂基因功能的研究提供了参考，并为piggyBac转座子转基因载体在基因功能的相关研究中的应用提供了广阔的前景。

2 RNA干扰技术

RNA干扰是指利用外源或内源的双链RNA特异性抑制靶基因转录后表达的现象，它通过导入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，进而诱导内源靶基因的mRNA的降解，达到阻止基因表达的目的[16,17]。RNA干扰能特异性地引起基因表达沉默，是生物体抵御病毒和外源基因的入侵而特异性地调节或干扰基因表达的一种“免疫”应答机制。昆虫上RNA干扰的方法主要有注射、饲喂、浸泡、病毒转染等。

RNA干扰在昆虫上的应用最早是应用在黑腹果蝇上[18]。有关蜜蜂RNA干扰报道是在1988年，Milne等[19]对意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）的早期胚胎进行了显微注射的初步探索，他们将产下的卵置于带有双面胶胶条的玻片上，在卵的后端注射石蜡油，其中有21%的卵成功孵化。邵瑞宜等[20]利用显微注射技术同样注射石蜡油到中华蜜蜂1日龄卵内，其孵化率达到35.13%。Beye等[21]将dsRNA注射到意大利蜜蜂前囊胚期胚胎的前端，结果显示注射的dsRNA片段成功干扰整个胚胎期目的基因的蛋白表达，并导致表型缺陷，而注射无意义密码子的dsRNA没有显示异常现象，这是蜜蜂上关于靶向干扰基因功能的第一篇报道。Amdam等[22]给蜜蜂0～6 h的卵注射dsRNA，由注射dsRNA的卵孵化而来的蜜蜂，有15%的蜜蜂其卵黄蛋白原的mRNA水平明显降低。他们又将dsRNA注射到新出房蜜蜂的腹内，其中有96%的蜜蜂的表型发生突变。石元元等[23]给3日龄的意大利蜜蜂的幼虫注射DNA甲基化转移酶3（Dnmt3）siRNA，并分别注射Ringer、uth siRNA作为对照，在注射后的24 h，48 h，72 h分别测定Dnmt3酶活性、mRNA的表达量以及相关基因的甲基化水平，并在蜜蜂羽化后测定其形态指标，结果注射Dnmt3 siRNA的蜜蜂幼虫其初生重、体长以及第3背板长均显著提高，进而说明了Dnmt3影响蜜蜂幼虫的发育。Li-Byarlay等[24]通过在1日龄蜜蜂的腹部注射siRNA抑制DNA甲基转移酶3（dnmt3）的表达，证明了蜜蜂的DNA甲基转移酶3影响基因的可变剪接。Costa等[25]利用RNA干扰技术抑制骨化激素基因，导致成年蜜蜂表皮完整性的形成以及表皮的黑化和硬化受到影响，从而证明了骨化激素在成年蜜蜂表皮的形成和黑化过程中具有重要作用。

RNA干扰具有简单方便、实验周期短、特异性强等特点，得到广泛应用，成为验证基因功能强有力的工具。而实现昆虫高效的RNA干扰，其关键是选择合适的导入dsRNA的方法。如注射法，蜜蜂的卵容易获得，而且卵较大，卵膜较薄，易于注射针穿过注射，方便操作。但是注射不可避免的会对昆虫造成损伤，如果将注射过的蜜蜂的卵或者幼虫放到蜂群中哺育，这些经过注射的卵或者幼虫会因为损伤而被清理掉，给实验造成困难。另外，注射效率以及卵的存活率受到操作的熟练程度、注射时间、注射剂量、注射压力、环境等方面的影响[20,26,27]，因此，利用显微注射技术进行RNA干扰时，为提高干扰效率，需要优化各种相关条件。再如饲喂法，饲喂法具有操作简单，不会对昆虫造成伤害等优点，但研究表明，不同的基因其通过口腔传输的RNA干扰的敏感性不同[28]，是否所有基因都能通过饲喂法达到RNA干扰的目的还有待研究。有研究表明，dsRNA 5’端的基团对干扰也会产生影响[29]。

3 CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术

基因组定点编辑技术又称基因打靶技术，是对生物体遗传信息进行定向修饰的一种实验手段。通过编辑后的遗传信息在生物体中的遗传表达，实现对基因功能的研究与分析。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成的一项新兴的RNA靶向的基因组定点编辑技术[30]。2013年，CRISPR/Cas9基因编辑技术被英国《自然》杂志子刊评为2013年年度方法，美国科学杂志将该技术评为2013年年度十大突破之一[31]，虽然该技术出现较晚，但具有巨大广阔的应用前景和发展潜力。

CRISPR/Cas9基因打靶技术虽然是一种新工具，但已经成功应用于多种生物体，如大肠杆菌[32]、酿酒酵母[33]、果蝇[34]、斑马鱼[35]、小鼠[36,37]、大鼠[38]、小麦[39]、水稻[39,40]以及人类[41]等。尉伟[42]运用TALEN及CRISPR-Cas9技术在蜂卵上进行了基因打靶实验，尉伟将TALEN mRNA及Cas9/gRNA分别注射到5～6 h的蜂卵中，人工培养48～60 h后进行酶切检测，结果两种技术均检测到了突变。Kohno等[43]给3 h的蜜蜂的受精卵注射sgRNA和Cas9 mRNA，运用CRISPR/Cas9技术成功获得了突变体。由此表明，CRISPR/Cas9基因编辑技术在蜜蜂中也可有效发挥基因敲除功能，并且可为后期蜜蜂功能基因的验证及突变体的获得提供有利工具。

与其他基因组定点编辑技术相比，CRISPR/Cas9只需要改变一段RNA序列即可识别多个不同位点，省去了重新合成不同蛋白的步骤，具有成本低、效率高，可同时修饰多个碱基，适用范围广等优势。该技术不仅可以直接在细胞内进行多个基因的编辑，而且可以定向修饰生物活体的遗传信息，同时还克服了蜜蜂胚胎不可逆的问题，主要缺点是有可能会出现脱靶现象[44]。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一项新兴技术，从一出现，就受到广大科研工作者的极大关注，虽处于起步阶段，但已得到广泛应用，并显示出明显的优势，另外，有研究表明，利用CRISPR-Cas技术实现的基因修饰可传递到下一代[45]。随着研究的深入和CRISPR/Cas9基因编辑技术的优化，相信CRISPR/Cas9系统的应用范围会更加广泛，也必定会成为基因功能分析的重要工具。

4 展望

蜜蜂作为一种重要的经济传粉昆虫和行为学等研究的模式动物，其基因的功能等待挖掘与研究。蜜蜂的社会性、清洁行为以及雌性蜜蜂的级型分化现象等都赋予了蜜蜂一定的特殊性，探讨基因的功能及其联系，有助于我们更加全面的了解蜜蜂的生物学特性，并为其他生物的研究提供借鉴。在分子生物学技术不断深入和发展的同时，再结合蜜蜂的特殊性将其加以优化完善，相信在不断的研究探索下，蜜蜂功能基因的研究会取得重大进展与突破。其中，RNA干扰的方法较多，在蜜蜂的任一发育阶段均可进行，可操作性优于转基因技术，且应用广泛，相关研究也比较多，如果再结合成熟的人工孵化技术，RNA干扰更有可能成为未来蜜蜂功能基因研究的主要技术，具有广阔的应用前景。

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Research advance on the function gene verification technologies of honeybee

Pang Qian,Zhang Wenwen,Wang Kang,Ji Ting
(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009)

Honeybee is important research object and model animal of social behavior and ecology,its functional gene research is of great significance.However,the problem of honeybee functional gene research is enhanced by the sociality phenomenon and the comb cleaning behavior of bees.The honeybee functional gene research is relatively undeveloped.In this review,in order to provide a reference basis for the research of the bee functional genes,we described the research results of transgenic technology,RNAi and CRISPR/Cas9.Meanwhile,we made the prospect of functional gene research in honeybees.

honeybee;gene function;verification technologies

国家自然科学基金（31372382）；国家蜂产业技术体系专项经费（CARS-45-SYZ6）

庞倩（1994-），女，硕士研究生，E-mail：18852717155@163.com

吉挺（1974-），E-mail：tji@yzu.edu.cn