体细胞核移植技术在猪育种上的应用

张立苹 郑新民

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉430064）

品种繁育

体细胞核移植技术在猪育种上的应用

张立苹 郑新民*

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉430064）

基因工程带动了生物工程的迅猛发展，转基因技术在改良家禽品种上得到广泛的应用。本文就体细胞克隆猪的关键技术加以论述。

体细胞；核移植；猪

育种学家多年以来都致力于通过各种育种手段来改良家禽及猪的优良品种，大多数育种学家都采用传统的育种手段——挑选优良品种的猪种进行杂交而得到优良的猪种。但此方法效率很低，一个品种的培育需要十年甚至更长时间，且在培育过程中很可能把不良的性状传给后代，不能按人们的意愿定向改良猪的特性。随着细胞生物学和分子生物学的发展，科学家将转基因技术和现代繁殖技术应用于猪的育种上，这大大缩短了育种周期，而且还能将人们所需性状的目的基因转移到猪种上，基本实现定向改良的目的。

1997年，世界首例体细胞核移植后代“多莉”的克隆成功，成为生命科学研究的一个里程碑。随后，世界各国掀起了体细胞克隆研究的热潮，小鼠[1]、牛[2]和山羊[3]等动物体细胞核移植后代相继诞生，体细胞核移植转基因猪的研究也得到快速发展。本文就体细胞克隆猪的关键技术加以论述。

1 受体细胞(猪卵母细胞)的准备

1.1 卵母细胞的来源

利用体细胞核移植技术获得克隆猪需要大量的成熟卵母细胞，获得体内成熟卵母细胞的操作繁琐、成本较高、数量较少。目前，用于体细胞核移植所需要的卵母细胞一般来源于体外培养的成熟卵母细胞，即采用屠宰场废弃的猪卵巢上抽取的卵母细胞进行体外成熟后，作为体细胞核移植的受体细胞。

1.2 卵母细胞的体外成熟培养

猪卵母细胞的体外成熟是猪体细胞核移植转基因猪生产中的重要环节。目前，一般采用的猪卵母细胞体外成熟培养条件为：39℃，5%CO2，95%空气，培养时间为42～44小时。卵母细胞的体外培养基，现在普遍采用NCSU-23。

1.3 成熟卵母细胞的处理

将成熟培养44小时的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）移入含0.1%透明质酸酶的DPBS中消化并用移液枪反复轻微吹打以除去卵丘细胞，用已经在二氧化碳培养箱中平衡2小时以上的操作液洗涤3次后备用。

2 供体细胞的选择与制备

体细胞核中含有物种特有的遗传信息，因此，体细胞核移植技术中，供体细胞的选择和制备是体细胞核移植转基因动物生产技术的重要组成部分。一般而言，根据试验的目的选择相应的个体。猪体细胞核移植发展较晚，目前，猪体细胞核移植以胎儿成纤维细胞和颗粒细胞作为供体较多。传代培养的细胞在核移植技术中现已被广泛应用[4]。研究表明，G0期或G2/M期的供体细胞均能有效地在受体中进行正常核的重编程。

3 核移植操作技术

体细胞核移植的显微操作由去核和移核两部分工作组成。去核即去除成熟卵母细胞内的核遗传物质，目前，常用的去核方法有盲吸法（即用显微操作仪将核吸出[5-7]，用X线照射的方法去核[8]，是应用秋水仙胺的化学去核方法）、纺锤体探测法、荧光染色去核法等几种。其中，盲吸法的应用最为普遍。移核的方法主要有透明带下注射和胞质内注射两种，其中胞质内注射一般用压电-陶瓷系统直接把供体细胞核注入胞质内；透明带下注射是把整个供体细胞注射至卵母细胞的卵周隙，然后再进行融合[9]。

4 重构胚胎的人工激活

利用理化因素的卵子激活即卵母细胞的人工激活，卵子人工激活得到的胚胎是人工孤雌生殖的产物。细胞核移植的效率与重构卵的电融合以及激活的效率紧密相关。提高融合率，是提高核移植效率的主要途径之一。常用的激活方法可归纳为物理激活、化学激活以及物理和化学联合激活等几种。激活途径有两种，一是钙离子信号通路，钙离子载体和电刺激等通过激发单脉冲性钙离子升高而实现。二是MAPK通路，蛋白质合成抑制剂、蛋白磷酸化抑制剂等通过调节蛋白激酶或蛋白磷酸酶活性，降调MPF、CSF而诱导卵母细胞激活。

5 重构胚的体外培养

目前，猪体细胞核移植重构胚胎的体外培养一般用PZM-3或NCSU-23培养基。培养方法主要有微滴培养法（是应用最广泛、最简单的一种胚胎培养方法）、套皿培养法、微穴培养法（Vajta等[10]在牛体外受精合子的培养中最早使用）、玻璃微管培养法（Thouas等[11]在研究小鼠合子的发育培养时首次应用）、明胶孔培养法等。

6 胚胎移植

猪胚胎的移植方法有非手术法、内窥镜法和手术法等。最早开展非手术法猪胚胎移植的是Polge等[12]，他们得到了一头妊娠母猪，屠宰后发现有3枚胚胎。内窥镜法的使用与术者的熟练程度密切相关，对术者的技术水平要求较高，因此采用这种技术，妊娠率的差别很大。目前，猪胚胎的移植，尤其是转基因胚胎的移植一般采用手术法。核移植重构胚胎移植数量一般在100枚以上。其中，1～4细胞期的重构胚胎移入受体母猪的输卵管内，8细胞期及以上发育阶段的重构胚胎应移入受体母猪的子宫角内。

7 结语

目前，猪的体细胞核移植技术已取得了明显进展，虽然还存在克隆效率低、克隆动物体细胞突变等问题，但是，使用该技术可以对猪基因组进行定点修饰，随着该技术的不断完善和发展，我们相信，体细胞核移植技术在猪的遗传改良中仍具有广阔的应用前景。未来这一技术必将极大地促进和推动转基因猪在农业和医药领域的应用。

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S813.3；S814.8

A

1673-4645(2017)09-0038-02

2017-08-21

转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006001-005），湖北省农业科技创新中心（2017-620-004-001），湖北省农业科学院青年基金（2016NKYJJ19），湖北省农业科学院竞争性项目（2016jzxjh013），湖北省技术创新专项重大项目（2016ABA117）

张立苹（1982-），女，河北邢台人，主要从事动物生物技术研究，E-mail：chzlp1982@163.com

*通迅作者：郑新民，研究员，主要从事动物生物技术研究，E-m ail：anb it20@163.com