肿瘤坏死因子受体相关因子6与骨代谢的研究进展

张群燕 郭郡浩 蔡辉

南京军区南京总医院中西医结合科，江苏 南京 210002

肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF6)是细胞内信号传导通路上的关键接头蛋白。因其能直接和CD40、IRAK以及NF-κB受体激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相结合，进而激活转录因子NF-κB、JNK/p38、AP-1通路，影响细胞的生成、增殖、分化和死亡而备受关注[1,2]。骨代谢是骨组织不断进行改建活动的一个复杂过程，包括骨吸收和骨形成两个方面。近年来，有关TRAF6在骨代谢方面的研究较多，其结果颇具争议，现就TRAF6在骨代谢中的研究进展作一综述。

1 TRAF6蛋白结构及生物学功能

1994年，Rothe等利用酵母双杂交技术和免疫沉淀反应发现了两种能与TNFRⅡ特异性结合的胞内信号接头蛋白并命名为TRAF1、TRAF2，随后在哺乳动物中又发现几种TRAFs蛋白，分别为TRAF1-TRAF6，并统称为TRAF家族(tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)。

TRAFs蛋白在进化上非常保守，且有着十分相似的结构特征[3]，即①TRAF分子C端都含有一个约200个氨基酸残基的TRAF结构域，主要接受外来信号。其中，TRAF又分为TRAF-N和TRAF-C两部分，TRAF-C可与不同受体蛋白胞内段的TRAF结构域或胞浆内其他含有TRAF结构域的蛋白结合，依赖TRAF-N端的环-环α螺旋结构(coiled-coil)形成同源或异源二聚体或多聚体。虽然有文献将新的蛋白质被命名为TRAF7[4]，但这种说法是有争议的，因为该蛋白不具有定义TRAFs的TRAF同源结构域。②除了TRAF1以外，TRAF分子N端依次有三个域，第45～106位是含有两个锌原子、7个半胱氨酸的环指模序(ring finger motif)，第110～264位有5到7个锌指(zinc finger，ZF)结构域，第287～342位有螺旋轮结构。这种结构将膜上的信号传导至下游，激发一系列信号通路，从而发挥不同的生物学功能[5]。

1996年，Ishida等[6]使用cDNA文库的酵母双杂交系统和筛选技术，发现TRAF6介导CD40参与NF-κB活化的信号转导；随后，Cao等[7]发现TRAF6可以与白细胞介素受体相关激酶(IL-1R-associated kinase，IRAK)绑定结合，在配体的刺激下，接头蛋白MyD88通过保守的C端胞质结构域TIR(Toll/IL-1R homology region)被募集到IL-1R或TLR复合体上，参与NF-κB活化的信号转导。

现已证实，人TRAF6基因定位于11p13，编码的蛋白质为511个氨基酸残基，是一种泛素连接酶，广泛分布在脑、肺、肝、骨骼肌、肾脏等组织中，心、脾、睾丸也有少量表达。结构上由于N端独特的TRAF-C结构能结合不同的蛋白分子，使TRAF6既参与CD40的信号转导又参与IL-1R/TLRs的信号转导[2,8]，是TRAFs家族中唯一一个可以直接和CD40、IRAK以及NF-κB受体激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)相结合的衔接蛋白，但所介导的结果似乎相似，皆可激活NF-κB[9,10]。在多种病理生理如先天免疫和适应性免疫，骨代谢和淋巴结的发展，乳腺/皮肤和中枢神经系统的形成等过程中发挥着重要作用。

2 TRAF6与破骨细胞

破骨细胞(osteoclast，OC)是来源于骨髓单核/巨噬细胞系经单核巨噬细胞系的前体细胞分化为具有抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)阳性的多核细胞，在骨营养激素和骨微环境产生的局部因子调节下，在骨吸收部位分化为破骨细胞，行使骨吸收的功能。现已证实，核因子κB受体激动剂(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)是破骨细胞分化与成熟过程中的重要因子，成骨细胞合成的NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand)与破骨前体细胞上的RANK的结合后，激活胞内信号转导途径，使破骨细胞分化加快，凋亡抑制，最终导致破骨细胞数量增多，骨吸收功能亢进。因此，RANKL/RANK通路也被认为是介导破骨细胞分化成熟的最重要的信号通路[11,12]。近年来的研究发现，TRAF6作为细胞内信号传导的重要接头蛋白在RANKL/RANK介导的破骨细胞分化与成熟过程中起着不可或缺的作用。

研究发现，RANK与RANKL结合后，促使RANK胞内区与TRAF分子C端相结合，而能与RANK结合的TRAF有TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6，且不同类型的TRAF与RANK不同的氨基酸位点结合[2]。Armstrong等[13]用敲除不同TRAF结合位点的突变将RANK cDNA的不同区域转染至无RANK的造血祖细胞的方法，发现RANK的胞浆段含有多个TRAF结合区，其近膜端基序结合TRAF6，C端区域结合TRAFs 1、2、3、5。且TRAF6是维持破骨细胞骨架形成和骨吸收作用所必须，其作用不能由TRAF2和TRAF5替代。

Kadono等[14]发现RANK在胞内有3个TRAF6部位，且这三条通道均能独自介导RANK信号途径。Ye等[2]发现RANK与TRAF6的结合部位有一种Pro-X-Glu-X-X-芳香族/酸性残基的序列，此序列在CD40和IL-1R的TRAF6的结合部位中也存在，而在其余TRAF蛋白中存在明显差异，也许正是这种差异导致了TRAF6与相关结合膜蛋白如RNAK结合的特异性。

Kobayashi等[15]发现，将缺少环指结构的突变TRAF6蛋白分子导人TRAF-/-的小鼠破骨细胞前体细胞内，在M-CSF和RANKL的刺激下，前体细胞只能分化为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)阳性的破骨细胞样细胞(osteoclast-like cell，OCL)，而无法形成肌动蛋白环，即无法发挥骨吸收作用。用同样的方法还发现，缺少第二和第三位锌指结构的TRAF6蛋白，无法使破骨细胞前体细胞分化为OCL。

由此可见，RANK与TRAF6的结合是RANKL/RANK信号下传的第一步，在破骨细胞的分化和成熟中每一个位点的结合都是十分重要的。TRAF6的C端与RANK结合后，诱导其位于N端募集胞浆内其它含有TRAF6的蛋白分子，使TRAF6三聚化，形成RANK-TRAF6-转化生长因子β激活激酶1(TAK1)结合蛋白2(TAB2)-TAK1复合物，诱导TAK1活化[16]，进而激活NF-κB、c-Src以及促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)下传RANKL/RANK信号发挥调节OC数量及活性的作用；另一方面某些因子也经TRAF6发挥作用，如TNF可经TRAF6促进OC生成，而白介素(IL-1)通过TRAF6抑制OC凋亡[17]。所以TRAF6在RANKL的细胞内信号转导中起枢纽作用。

Lee等[18]发现，RANKL/RANK结合后首先以振荡模式瞬时招募TRAF6绑定，随后，TRAF6在RANKL刺激下以非振荡模式与RANK相互作用。这表明RANK振荡募集TRAF6可能介导了RANKL诱导的MAPK信号通路的激活。在M-CSF和RANKL的刺激下，TRAF6缺失(TRAF6-/-)的破骨细胞前体不能分化为破骨细胞，说明TRAF6在前体细胞向OC和巨噬细胞分化的分支点发挥重要作用。TRAF6-/-细胞中RANKL诱导的p38活化不明显，而RANKL诱导的ERK和JNK活化以及M-CSF诱导的ERK、p38和JNK活化并不受影响；进一步研究发现，TRAF6-/-细胞中活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)和c-Fos的表达下调，NFATc1、c-Fos以及p65向核内转运受阻。表明RANKL/RANK/TRAF6信号通路通过持续激活p38后可上调破骨细胞转录因子的和促进破骨细胞分化[19]。

Yen等[20]的研究发现，在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的刺激下，人源单核细胞和小鼠RAW264.7细胞系p38 MAPK、JNK、ERK的磷酸化明显增强，骨吸收活性明显；但被TRAF6 siRNA转染后，前体细胞只能分化为TRAP阳性的OCL，p38 MAPK、JNK、ERK磷酸化受抑制，NFATc1表达下调，骨吸收活性明显降低，且在TRAF6-/-骨髓巨噬细胞，TRAIL诱导破骨细胞分化作用被完全抑制，表明TRAF6依赖的信号传导不仅在TRAIL诱导破骨细胞分化作用中起主要作用，还参与破骨细胞活化，并可以通过TRAF6等除RANKL以外其它TNF超家族分子来调控RANK信号传导。

Nakamura等[21]发现，前破骨细胞在IL-1刺激下，TRAF6可与c-Src作用形成TRAF6/c-Src分子复合物，使p130Cas、蛋白质酪氨酸激酶2、c-Src磷酸化，诱导其骨架重构分化为破骨细胞。c-Src缺如的OCL免疫共沉淀法将无法检测到TRAF6复合物的形成，进而影响肌动蛋白环和胞膜的微皱褶形成障碍，使OCL无法正常黏附于骨表面并发挥骨吸收的作用。

肿瘤坏死因子受体相关因子联合核因子-κB激酶(TRAF family member-associated NF-κB activator，TANK)可与TRAF6结合介导NF-κB通路负向调控破骨细胞的分化。研究发现，在RANKL诱导的破骨细胞前体细胞中，TANK mRNA 和蛋白均出现低表达。而体外TANK-/-小鼠出现明显的骨小梁损失，骨皮质密度增加，进一步检测发现胞内TRAF6泛素化上升，经典途径NF-κB生成增多，破骨细胞的转化明显增加[22]。

TRAF6与RANK结合被泛素化后，形成RANK-TRAF6-转化生长因子β激活激酶1(TAK1)结合蛋白2(TAB2)-TAK1复合物，最终激活NF-κB信号通路。NF-κB是破骨细胞分化所必需的细胞因子，有研究发现，NF-κB1/2双基因敲除小鼠与RANKL/RANK双基因敲除小鼠的破骨细胞分化障碍相似，它们的破骨前体细胞都停止在分化阶段，不能够表达破骨细胞分化的重要作用因子，如：TRAP、组织蛋白酶K、降钙素受体等，使破骨前体细胞数量增加，但是凋亡没有增加；且由于缺少破骨细胞导致的骨骼硬化症[23]。由此可见，RANK与TRAF6的结合在破骨细胞形成的每一步中都是十分重要的。

3 TRAF6与成骨细胞

成骨细胞(osteoblast，OB)是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。过去的几年内，有关成骨细胞的分化、成熟调控的分子机制不断被完善，如Wnt蛋白、骨形成蛋白(bone morphogenic protein，BMP)、成纤维生长因子、胰岛素样生长因子等，以及抑制成骨细胞分化增殖的细胞因子如肿瘤坏死因子等[24]。近年来研究发现，TRAF6参与TGFβ家族成员引起的TAK1-MAPKs的激活，在成骨细胞的分化成熟等方面起着重要作用[27]。

BMPs属转化生长因子-β超家族成员，是一组结构相关的多功能蛋白，在各种器官发生(包括骨和软骨的形成)中起重要作用，其主要通过结合并激活细胞膜上特异性受体，通过Smads依赖性和Smads非依赖性两种途径传递信号，促进MSCs向OB分化。研究发现，TRAF6过表达降低Smad1蛋白稳定性抑制Smad1的表达，进而抑制成骨细胞的分化和骨矿化；而TRAF6-/-小鼠上调Smad1的表达，说明TRAF6可以通过BMP-Smad1通路调控OB的分化。进一步研究显示，TRAF6不能促进OB的增殖，但是其通过Runx2和Osx的表达抑制成骨细胞的分化，且该抑制作用可以被Smad1逆转，表明TRAF6与成骨细胞的分化关系密切，该作用通过Smad1介导，调节BMP通路抑制OB的分化[25,26]。

RUNX2是转录因子RUNXX家族成员之一，作为成骨细胞的特异转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。有研究发现，间充质前体细胞Runx2在TAK1-p38蛋白轴Smads非依赖性途径的激活是必不可少，质子泵抑制剂兰索拉唑可以与泛素C末端结合抑制去泛素酶CYLD活性进而增强TRAF6的多泛素化，上调RUNX2的表达，随后RUNX2通过与成骨细胞特异性顺式作用元件2(OSE2)相结合刺激碱性磷酸酶(ALP)的表达，从而间接刺激间充质干细胞向OB分化[28]。

目前相关研究主要集中在破骨细胞，有限的研究尚不能确定TRAF6表达与成骨细胞之间的联系，进一步深入研究两者之间的关系，也许在骨代谢性疾病的防治方面可开辟一条可行的新途径。

4 TRAF6与骨代谢性疾病

Lomaga等[29]发现4周龄TRAF6-/-小鼠表现为严重骨骼硬化症如长骨特别是股骨长度变短、基底部变宽，扁骨的骨骼结构和形态显示正常，X平片提示骨密度增加以及没有门牙和臼齿等牙齿萌出缺陷表现。

李霞等[30]选用TRAF6-/-的大鼠，发现牙胚发育过程中TRAF6呈动态时空表达模式：从牙板开始增厚时牙板上皮细胞就表达TRAF6，尤其钟状早期内釉细胞及钟状晚期(硬组织形成期)成釉上皮细胞质TRAF6强阳性表达；牙乳头间充质细胞及成牙本质细胞在钟状早期时TRAF6呈阳性表达，至硬组织形成期成牙本质细胞质强阳性表达TRAF6，而牙乳头间充质细胞变为弱阳性表达，至出生后7d时未见表达。表明TRAF6可能在牙胚细胞增殖、分化和发育中发挥重要作用。

Zhu等[31,32]研究发现，RA患者滑膜组织TRAF6表达与血清骨代谢标志物I型前胶原氨基端前肽(PINP)、骨钙素降解产物(N-MID.OC)呈正相关(r=0.381，0.345，P<0.05)。提示滑膜TRAF6表达增加可能与RA代偿性骨形成增加有关，TRAF6可能通过介导滑膜炎症参与了RA的骨代谢失衡。具体机制可能与TRAF6在破骨细胞膜与RANK结合并激发了TRAF6的募集并进一步激活NF-κB和NFATcl促使破骨细胞的形成有关。

Liu等[36]通过培养人关节软骨细胞(从骨关节炎患者收获)，用IL-1β刺激的软骨细胞TLR4和下游的信号分子MyD88和TRAF6显著上调，以及由此刺激TNFα的合成和NF-κB的活化均有明显增加。表明TRAF6可能在骨关节炎患者软骨病变过程中发挥重要作用。

p62/SQSTM1是一个由SQSTM1编码的多功能泛素结合蛋白，其一级结构序列中有一个可以与TRAF6结合的结构域[33]。有研究发现，在RANK诱导信号中，p62蛋白通过与TRAF6聚集形成p62-TRAF6信号复合物，与非典型蛋白激酶C(aPKC)蛋白相互作用，通过NF-κB抑制物的激酶(IKKb)的磷酸化，调节NF-κB的活化，促进破骨细胞的形成及活化，在骨代谢的调节及骨质疏松的形成中发挥重要的作用[34]。SQSTM1基因突变是在Paget骨病患者中检出率最高的基因突变，有研究发现，p62蛋白的变异减弱了p62与TRAF6的结合能力，导致了NF-kB信号通路的增强以及增加了破骨祖细胞对RANKL、TNF的敏感性[35]，因此调控TRAF6有可能成为研究和治疗Paget骨病的一种方法和手段。

5 总结与展望

骨代谢是骨组织不断进行改建活动的一个复杂过程，其中破骨细胞发挥吸收骨基质的功能，而成骨细胞起着合成骨基质的作用，二者相辅相成，缺一不可。随着骨免疫学的发展，研究破骨细胞/成骨细胞的分化成熟与免疫炙手可热。TRAF6是近年来在骨代谢及骨免疫中起重要调节作用的接头蛋白，其不仅参与CD40、IL-1R/TLRs信号转导激活的NF-κB和JNK信号通路调控DCs细胞、B细胞的成熟、增殖和分化，还介导RANKL/RANK通路直接或间接作用于骨分化，特别是对破骨细胞的分化、成熟、活化等各个方面都有影响，研究亦较多和成熟，而有关成骨细胞相关研究有待进一步开展，以期为骨质疏松、骨关节炎等疾病的治疗开拓新的思路。