一种血红密孔菌色素提取工艺优化及稳定性研究

张新欣，敖天杰,张成程，江 念，郑小江,*

(1.湖北民族学院 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)



一种血红密孔菌色素提取工艺优化及稳定性研究

张新欣1，敖天杰2,张成程2，江 念2，郑小江1,2*

(1.湖北民族学院 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

以一株含有大量红色色素的野生血红密孔菌子实体为试验材料，以提取温度、乙醇体积分数、提取时间3个因素为指标对其进行了色素提取工艺优化，并对该子实体色素的稳定性进行了研究.其结果表明：血红密孔菌子实体色素的最佳提取工艺条件为：提取温度为85℃，乙醇体积分数为70%，提取时间为80 min，色素含量3.84 mg/g.色素稳定性研究表明，该色素对温度、氧化剂、还原剂、金属离子等的稳定性较好，在食品、工业中具有较大的开发利用价值，值得更加深入的研究.

血红密孔菌;色素;提取工艺;稳定性;抗氧化

目前，天然色素的开发与利用已受到广泛的关注和重视.近年来很多学者对天然色素进行研究得到了丰富的成果.绝大部分的天然色素都是从植物中提取得到的，还不能满足现实的需求，开发新型色素资源可为解决这一问题提供一个途径.我国大型真菌资源丰富，如果从中筛选出一些色素含量高，又具有一定的食用及保健价值的色素种类，则非常具有开发利用潜力[1-4].多孔菌是人类开发利用比较多的一类大型真菌，具有许多重要的用途和价值.多孔菌中的牛肝菌、地花菌、硫磺菌、灰树花等味道鲜美可以食用，茯苓、雷丸、猪苓、云芝等是名贵和常见的中药材，并且多孔菌科中尚未发现有毒的种类[5]；多孔菌产生的木质素分解酶可应用在染料降解、纸浆漂白、动物饲料生产等许多方面[6].

于萍[7]从凤眼莲中提取的色素主要成分为脱镁叶绿素a、β-类胡萝卜素和叶绿素衍生物，可上染锦纶织物和羊毛织物.张梁等[8]从土壤中分离到一株产红色素细菌，对其色素结构进行鉴定，鉴定结果为灵菌红素.印度科研人员Bhuyan等[9]从巴戟、柚木、茜草等五种印度本地植物中提取色素.肖浩等[10]从千里光花中提取到一种脂溶性黄色色素并对其提取方法进行优化，得出运用水提法为较为经济的提取方式.赵珍珍[11]研究了红肉火龙果果皮、果肉红色素的提取工艺及稳定性，得出温度、氧化剂、还原剂、金属离子为影响色素稳定性的主要因素.目前，对于色素的提取研究主要集中在植物中，以为微生物为材料提取色素的研究较少.但微生物的繁殖以及培养更为简易，大力发展微生物色素在食品和工业中的潜力巨大.

本试验以血红密孔菌实体为试验材料研究其色素的提取工艺及稳定性，旨在为筛选具有开发潜力的天然色素提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

2014年初冬，从武汉东湖附近的一棵刺槐树上采集的橙红色野生菌子实体.分子生物学鉴定采用ITS序列分析方法，通过构建系统进化树发现该野生菌与菌株Pycnoporussanguineus聚在同一分支上，它们的相似度为99%.最终鉴定该野生菌为担子菌纲、多孔菌科、密孔菌属、血红密孔菌，命名为PycnoporussanguineusZXJ.ZCC(该命名过程另撰文发表).

1.2 实验仪器

FA1204N电子天平(上海丙林电子科技有限公司)；TissueLyserⅡ高通量组织研磨仪(上海净信实业发发展有限公司)；TDL-40BD离心机(上海安亭有限公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限责任公司)；PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司).

表1 因素水平表Tab.1 Factors level table

1.3 药品和试剂

石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇、盐酸、氢氧化钠、双氧水、硫酸氢钠、维生素C、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁、氯化铝、硫酸铁、硫酸亚铁、β-胡萝卜素.

1.4 实验方法

1.4.1 色素提取工艺流程 提取路线：烘干→粉碎→过筛(80目)→加入提取溶剂→水浴→离心→过滤→色素提取液.

1.4.2 色素含量测定方法 取0.2 g血红密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，75℃水浴40 min，水浴期间要不时震荡，在4 000 r/min条件下离心10 min，用一次性过滤针头过滤，并定容至25 mL，在190～1 100 nm范围内进行波长扫描，确定最大特征吸收波长为445.5 nm.

1.4.3 提取溶剂选择 分别用蒸馏水、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿提取色素，在445.5 nm处测定色素提取液的吸光度，确定最适提取溶剂.

1.4.4 标准曲线的配制 以β-胡萝卜素作为标准品，溶解于70%乙醇中，配制浓度分别为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、 3.50、4.00、5.00 μg/mL的标准液，在445.5 nm处测定各标准液的吸光度.以标准液的浓度为横坐标，以不同浓度标准液对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，在所取的浓度范围内，其浓度和吸光度呈现出良好线性关系，得到标准曲线为:Y=0.157 32X+0.002 06，R2=0.999 85.

1.4.5 单因素试验

1.4.5.1 提取温度选择 取0.2 g血红密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，于25、35、45、55、65、75、85、95℃中水浴40 min，离心，过滤，并定容至25 mL，在445.5 nm处测定色素提取液的吸光度，确定最适提取温度.

1.4.5.2 乙醇体积分数选择 取0.2 g血红密孔菌粉末，加入20 mL浓度依次为0%(即蒸馏水)、20%、30%、50%、70%、90%、100%的乙醇，75℃水浴40 min，离心，过滤，并定容至25 mL，在445.5 nm处测定色素提取液的吸光度，确定最适提取剂浓度.

1.4.5.3 提取时间选择 取0.2 g血红密孔菌粉末，加入20 mL 70%乙醇，于75℃中水浴20、40、60、80、100、120 min，离心，过滤，并定容至25 mL，在445.5 nm处测定色素提取液的吸光度，确定最适提取时间.

1.4.6 正交试验设计 根据单因素试验结果，设计L9(33)正交试验，进行PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素提取最佳工艺的优化.如表1所示.

1.4.7 色素稳定性试验

1.4.7.1 pH稳定性试验 取5 mL色素提取液，用1 mol/L的HCl或NaOH调节其pH值分别为1、3、5、7、9、11、13，室温放置30 min后测定445.5 nm处吸光度，同时做空白对照.

1.4.7.2 氧化剂与还原剂稳定性试验 取浓度梯度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的双氧水溶液、维生素C溶液、硫酸氢钠溶液各1 mL加入到5 mL色素提取液中，室温放置30 min后测定445.5 nm处吸光度，同时做空白对照.

1.4.7.3 金属离子稳定性试验 取5 mL色素提取液，分别加入质量分数为1%的氯化钙溶液、硫酸锌溶液、硫酸铜溶液、硫酸镁溶液、氯化铝溶液、硫酸铁溶液、硫酸亚铁溶液各1 mL，室温条件下静置30 min后，测定445.5 nm处吸光度，同时做空白对照.

1.4.8 数据处理 用Excel软件进行数据计算与整理，用统计软件SPSS 19.0进行数据分析.

注：相同字母之间表示无显著差异，不同大写字母之间表示存在显著差异(P<0.05，下同).图1 最佳溶剂的选择Fig.1 The choice of the best solvent

图2 提取温度对色素提取效果的影响Fig.2 Extraction temperature on the influence of pigment extraction

图3 乙醇浓度对色素提取效果的影响Fig.3 The influence of ethanol concentration of pigment extraction effect

2 结果与分析

2.1 溶剂选择

在相同条件下对溶剂蒸馏水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿和石油醚进行考察，结果如图1所示.

由图1可得，色素得率从大到小依次为甲醇、乙酸乙酯、乙醇、氯仿、蒸馏水、石油醚(几乎无吸收)，甲醇、乙酸乙酯、乙醇色素得率没有显著性差异(P>0.05)，考虑到用乙醇做为提取溶剂更安全和经济，因此后续实验选择乙醇作为提取溶剂.

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对色素提取效果的影响

在提取时间、乙醇浓度相同的条件下，考察不同温度对色素得率的影响，结果如图2所示.

由图2可知，色素得率着提取温度的升高而变大，则色素含量也随着提取温度的升高而越来越高，当温度为85℃时，其对应的色素得率最高.由显著性分析得知，当温度为85℃时，其对应的吸光度与95℃相比无显著差异(P>0.05)，但与其他温度相比均有显著差异(P<0.05)，说明当温度升到85℃后，继续升温对色素提取率的增加无显著影响，所以PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素提取温度宜选择85℃.

2.2.2 乙醇体积分数对色素提取效果的影响 在提取时间、提取温度相同的条件下，考察不同乙醇体积分数对色素得率的影响，结果如图3所示.

由图3可知，当乙醇体积分数为70%时，色素得率最大.当乙醇体积分数在0%～70%之间时，色素得率随着乙醇体积分数的升高而变大；当乙醇体积分数在70%～100%之间时，色素得率随着乙醇体积分数的升高而变小.由于乙醇体积分数越大，极性越弱；体积分数越小，极性越强.说明PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素具有一定水溶性.

由显著性分析得知，当乙醇体积分数为70%时，其对应的吸光度与其他体积分数相比均有显著差异(P<0.05)，即对于PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素提取效果最好的乙醇体积分数为70%.

2.2.3 提取时间对色素提取效果的影响 在乙醇、提取温度相同的条件下，考察不同提取时间对色素得率的影响，结果如图4所示.

图4 提取时间对色素提取效果的影响Fig.4 Extraction time on the influence of pigment extraction

注：※代表和对照有显著性差异，P<0.05.图5 pH对色素稳定性的影响Fig.5 The pH effect on the stability of the pigment

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交试验方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

表5 验证试验结果Tab.5 The table of verifying test

由图4可知，当提取时间为60、80、100和120 min时，其对应的色素得率之间无显著性差异(P>0.05)，但四者与20 min和40 min之间存在显著差异(P<0.05).从高效节能方面考虑，PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素提取时间取60 min较为合适.

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素提取最终的因素水平选择见表1，用SPSS19.0软件对正交数据进行分析得表2、表3.由表2和表3可知，3个单因素对PycnoporussanguineusZXJ.ZCC色素含量的提取结果都有一定的影响，在9组正交试验中，所得色素含量大小有很大的差别.提取温度对色素提取率有极显著影响(P<0.01)，乙醇体积分数对色素提取率有显著影响(P<0.05)，提取时间对色素提取率影响不显著(P>0.05)，3个单因素对色素提取效果的影响程度顺序为：A>B>C，即提取温度>乙醇体积分数>提取时间.结合表4可得，色素提取的最佳因子配比为A2B2C3，即提取温度为85℃，乙醇体积分数为70%，提取时间为80 min，此条件下测得的色素含量最高，为3.84 mg/g.

取0.2 g子实体粉末，按照提取温度为85℃，乙醇体积分数为70%，提取时间为80 min进行验证试验，结果如表5.结果表明，所得提取工艺稳定可行.

表4 Duncan多重比较结果

Tab.4 Duncan multiple comparison results

因素N同类子集1237531.5867A提取温度/℃8533.40329533.16335032.1100 B乙醇浓度/%7033.14679032.89674032.3667 C提取时间/min6032.85678032.9300

2.4 色素稳定性研究

2.4.1 pH对色素稳定性的影响 5 mL色素提取液，在不同pH条件下放置30 min，在波长445.5 nm条件下检测其吸光度，结果如图5所示.

图5为PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素在不同pH值下的吸光度.由显著性分析可知，当pH为5、7、9和11时，其对应的吸光度与对照相比差异不显著(P>0.05)；当pH为1、3和13时，其对应的吸光度与对照之间差异显著(P<0.05).表明该色素在pH5～11时较为稳定，但在强酸(pH<3)和强碱(pH>13)条件下，吸光度会显著降低，特别是在强碱条件下更为明显.

图6 氧化剂与还原剂对色素稳定性的影响Fig.6 Antioxidant and reducing agent effect on the stability of the pigment

图7 金属离子对色素稳定性的影响Fig.7 Metal ions effect on the stability of the pigment

2.4.2 氧化剂与还原剂对色素稳定性的影响 5 mL色素提取液，在三种溶剂不同摩尔体积分数条件下放置30 min，在波长445.5 nm条件下检测其吸光度，结果如图6所示.

加入不同摩尔体积分数的双氧水、维生素C、硫酸氢钠后，色素提取液的吸光度变化如图6所示.由显著性分析可知，在双氧水环境下，除当双氧水摩尔体积分数为0.4 mol/L时产生了显著差异外(P<0.05)，其他摩尔体积分数下均无显著差异；在维生素C环境下，当摩尔体积分数为0.4、0.6、0.8和1.0 mol/L时，与对照相比出现了显著差异(P<0.05)；在硫酸氢钠环境下，当摩尔体积分数为0.6、0.8和1.0 mol/L时，产生了显著差异(P<0.05).可知，该色素在氧化剂双氧水中要比在还原剂维生素C和硫酸氢钠中稳定.

2.4.3 金属离子对色素稳定性的影响 在色素提取液，分别加入质量分数为1%的氯化钙溶液、硫酸锌溶液、硫酸铜溶液、硫酸镁溶液、氯化铝溶液、硫酸铁溶液、硫酸亚铁溶液，室温条件下静置30 min后，测定445.5 nm处吸光度如图7所示.

图7的试验结果表明，除了Gu2+会引起PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素吸光度显著(P<0.05)降低外，Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+和Mg2+均会在一定程度上引起PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素吸光度显著(P<0.05)升高，其中升高的最多的是Fe3+，其次是Fe2+，而Ca2+则对PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素无显著影响.

3 结论与讨论

温度对提取PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素有显著的影响.温度越高，色素得率越大，说明血红密孔菌色素耐高温，热稳定性好.不同浓度的乙醇也对PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素得率产生一定的影响，试验结果显示，采用浓度为70%的乙醇作为提取剂，色素得率最高.采用乙醇作为提取剂，成本低，还可以实现回收再利用，降低生产成本.通过PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素多因素正交试验，最佳提取工艺为提取温度为85℃，乙醇浓度为70%，提取时间为80min.3个因素对色素提取效果的影响程度不同，提取温度>乙醇浓度>提取时间，其中，提取温度是提取血红密孔菌色素的关键因素.

色素稳定性对色素的开发应用极为重要，它直接影响并决定了色素的利用价值.因此本文对所得色素的稳定性进行了初步研究，以期为该色素的进一步开发应用提供一定依据.PycnoporussanguineusZXJ.ZCC子实体色素的稳定性研究表明，血红密孔菌色素的热稳定性相当好，即使在85℃的高温下依然稳定；除强酸强碱外，血红密孔菌色素在一般酸碱条件下稳定性也很好；血红密孔菌色素对氧化剂双氧水具有较好的稳定性，对低浓度的还原剂硫酸氢钠和维生素C稳定性较好，当浓度变高时稳定性变差；在金属离子环境中，Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+和Mg2+均会在一定程度上引起血红密孔菌色素吸光度的升高，而Gu2+会引起血红密孔菌色素吸光度降低，Ca2+则对血红密孔菌色素无显著影响.

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责任编辑：高 山

Study on Process Optimization and Stability of Pigment Extraction ofPycnoporussanguineus

ZHANG Xinxin1，AO Tianjie2，ZHANG Chengcheng2，JIANG Nian2，ZHENG Xiaojiang1，2*

(1.School of Forestry and Horticulture，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China)

In this study,a strain containing a large amount of red pigment in wildPycnoporusfruitbodyis taken as test material,and 3 factors,namely,extraction temperature,ethanol concentration and extraction time are used for the extraction process of optimization,and the stability of the fruiting body of pigment is studied.The results show that:optimum extraction conditions of blood red hole fruiting body pigment,70% ethanol,extraction temperature of 85℃, extraction time 80 min,pigment content 3.84 mg/g.The research results of pigment stability shows that the pigment has good stability,such as temperature,oxidizing agent,reducing agent,metal ion and so on. It has great development and utilization value in food and industry,and it is worth further research.

Pycnoporussanguineus;pigment;extraction process;stability;antioxidation

2016-11-24.

湖北省自然科学基金创新群体项目(2009CDA115)；生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目(PKLHB1525、1526); 恩施州技术研发项目(2013、2014).

张新欣(1991- )，女，硕士生，主要从事野生植物资源保护与利用的研究;*

郑小江(1958- )，男，教授，主要从事野生植物资源保护与利用的研究.

1008-8423(2016)04-0455-05

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2016.12.021

TS202.3

A