2015年国外甜菊研究回顾

刘 娜，李红侠，张文彬，胡晓航，3*

（1.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080；3.农业部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨150080）

2015年国外甜菊研究回顾

刘 娜1，2，李红侠1，2，张文彬1，胡晓航1，2，3*

（1.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080；3.农业部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨150080）

对2015年国外英文文献报道的甜菊及其提取物的研究概况进行回顾，为国内了解和掌握国外甜菊研发动态提供参考。

甜菊；提取物；甜菊糖苷；莱鲍迪苷；回顾

甜菊（Stevia rebaudiana）作为第三糖源，具有甘蔗糖和甜菜糖不可替代的十大优点：纯天然安全、热稳定性、零卡路里、对血糖无影响、非可发酵性、酸碱性稳定、比普通蔗糖甜150～300倍、无褐变反应、无脂肪和碳水化合物、防龋齿。还有特殊的药用与保健功效，因此受到国内外尤其肥胖症、糖尿病、代谢综合症等群体的青睐，因消费需求和应用逐年增加而得到长足的发展；全球甜菊产品产量由2009年的2750t逐年增长到2014年的4670t，预计2016年产量将达6250t，销售额将达4.9亿美元[1]。随着研究的深入，新的功能、新的方法被相继开发问世，尤其国外对甜菊的研究更为活跃，因此有必要了解和掌握国外甜菊的研究现况，以期对我国甜菊及其相关产品的研发提供参考与借鉴。

1 甜菊的组分

甜菊糖 （Steviol glycosides，SGs）是一类由甜菊醇 （Steviol）四环二萜化合物连接不同数目的配糖体（Glycoside）组成的糖苷混合物。目前研究发现的有十几种糖苷，被人们认可且做过医学毒理实验的有8种[1]：（1）甜菊糖苷（Stevioside，St）；（2）甜菊醇双糖苷（Steviolbioside，Stb）；（3）莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，Reb A）；（4）莱鲍迪苷B（Reb B）；（5）莱包迪苷C（Reb C）；（6）莱鲍迪苷D（Reb D）；（7）莱鲍迪苷E（Reb E）；（8）杜尔可苷A（Dulcoside A，Dul A）。

甜菊糖无热量，比蔗糖甜200倍左右，但它含有微量奇异果甜蛋白（thaumatin），一种甜蛋白，提供了16.7kJ/g的热量，是相同量蔗糖甜度的约2000倍[2]。

甜菊中除了含有的SGs外，还主要含有酚酸类和黄酮类物质，酚酸类包括：苯甲酸（Benzoic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、绿原酸（Chlorogenic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、原儿茶酸（Protocatechuic acid）、水杨酸（Salicylic acid）、Rozmaric acid等及其衍生物；黄酮类包括：山奈酸（Campherol）、儿茶酸（Catechin）、表儿茶素（Epicatechin）、毛地黄黄酮（Luteolin）、芦丁（Rutin）等及其衍生物[3]。

用水（A）、无水乙醇（E）和含水乙二醇（GA）做溶剂提取多酚和蛋白质，结果表明：含水乙二醇（GA）做溶剂中酚类和黄酮类的最高含量分别为15.50mg/g和3.85mg/g。所有提取物含有大量的蛋白质 （69.40～374.67mg/g）。用高效液相色谱法（HPLC）分析了GA法甜菊提取物含有最高数量的茶多酚，尤其是Ferulic acid（5.50mg/g）和Rozmaric acid（4.95mg/g）衍生物；最高的抗二苯基苦基苯肼（DPPH·）和二铵盐（ABTS·+）自由基活性是GA和E （IC50=0.38和0.71μg类黄酮/mL）；最高的Fe2+螯合能力是E（IC50=2.08μg类黄酮/ mL）。也分析了甜菊提取物的体外细胞毒性和纤维原细胞刺激潜力，E和GA最有细胞毒性和刺激性，可能是生物活性物质含量高[3]。

多糖菊粉在食品和医药行业被重视。菊粉的聚合度（DP）影响溶解性、热稳定性、甜度和益生元活性等重要属性。具有高聚合度的分子是通过物理技术浓缩菊糖链获得的，它们通常不是从植物中提取得到。气相色谱/质谱分析和1H核磁共振分析表明，甜菊根的菊粉聚合度（DPn 28）比其他植物物种的菊粉高12～15。而且，通过冻/解冻可以增加链进而增加DP，类似于其他方法用于菊糖链的浓缩；益生元化验证实了甜菊菊粉的DP高含量。表明甜菊根有望是高聚合度菊粉的资源[4]。

随着研究的深入，甜菊中新的未被认识的物质相继被发现。在甜菊提取物中分离出一种新的双萜糖苷：15α-羟基-莱鲍迪苷M，根据核磁共振说明SGs具有中环双萜核心C-15的羟基团，以前未曾报道过[5]。新型的甜菊氨基酸甜味剂——甜菊甘氨酸乙酯（ST-GL）和甜菊丙氨酸甲酯（ST-AL）被合成了，并测定评价了其感官属性及其毒性、熔点、溶解性和热稳定性，在酸性、中性或100℃持续2h的水溶液中是稳定的，其甜味高于蔗糖，ST-GL和ST-AL溶液没有苦味、甜味纯正，可用于低热量食品的生产[6]。

2 甜菊的提取、加工、分析、测定

采用两个不同的商用仪器ASCPC250和FCPE300（柱分别为1890和231双池）离心分配色谱法从甜菊叶的天然水提物纯化大规模的SGs；由乙酸乙酯、正丁醇和水梯度洗脱模式组成的双极相溶剂系统完成。当使用1890分区池离心分配色谱法250mL柱，从1 g初始混合物提取42mg St、68mg Dul A和172mg Reb A，纯度分别为81%、83%和99%；对231柱303mL（样品载量可增加到5 g）的强化生产率得到进一步提高，致使回收得到1.2g St、100mg Dul A和1.1g Reb A，纯度分别为79%、62%和98%[7]。

应用超声波和微波能技术，采用不同温度（50～100℃）、时间（1～40min）和微波能（1.98和3.30 W/g），从脱水甜菊叶固液萃取SGs（甜味剂）和抗氧化剂（总酚类、类黄酮和抗氧化能力），并与传统提取方法（大气压力下的高温）比较。结果收益率有很大的差异，SGs和抗氧化剂呈负相关关系。SGs得到最大的收益是微波能3.30 W/g提取2min；然而，传统方法（90℃、1min）是提取抗氧化剂最适合的。因此，最好的方法取决于甜菊叶水提物做为甜味剂或抗氧化剂的后续使用[8]。

为更快和可再生的需要，用加速溶剂萃取法优化自动提取甜菊干叶。采用效应面优化法（Response surface methodology）调查提取温度、静态时间和周期数3个因素对St和Reb A提取收益率的影响。结果表明，所有的因素都对收益率有影响，最佳提取条件是在100℃、4min和1个周期，收益率占总可抽出SGs的91.8%±3.4%；通过减少叶子研磨的大小完成了优化：最终收益率达100.8%±3.3%[9]。

用声波降解法进行甜菊叶中SGs提取的优化，测定了异丙醇浓度 （60%，v/v）、时间 （6～24min）、温度（30℃）和声波（300～480 W）对从叶中提取Reb A和用聚合物对提取液的脱色（赛派栏絮凝剂AP30和树脂ADS-7）的影响。结果表明，异丙醇适合于甜菊叶提取Reb A，在输出功率360 W、处理时间18min时，Reb A产量达到35.61g/100g。声波降解法对甜菊叶的粒度和提取液的颜色有影响，随着声波降解强度的增加，粒径降低了。不同处理下甜菊提取液的颜色差异显著。AP30和ADS-7可去除色彩的杂质，65%以上的有色杂质被AP30（结合氧化钙）去除掉[10]。

用喷雾、冻结和真空干燥箱干燥来降低SGs的苦味，并提高其性能。以80∶20、75∶25、70∶30、65∶35不同比的麦芽糊精与菊粉作为测定剂，而SGs占总固体的浓度维持在2.5%。结果不同干燥方法的微胶囊化效率（MEE%）、水分含量、结构和溶解度值差异显著；降低吸湿性值（20.26～26.67g水/100g DW）有助于提高稳定性；红外光谱技术证实，在干燥过程中SGs保持其化学完整性，喷雾干燥的SGs产品呈现最好的理化特性和最吸引人的感觉[11]。

甜菊叶一般是在干燥状态下使用，因此干燥过程必然对最终成品的质量产生影响。通过分析相关的生物活性组分、抗氧化性、天然甜味剂及矿物质含量来评价温度的影响。干燥过程是在对流烘干机30～80℃恒温完成的。结果，叶片中Vc含量与温度成反比，即随着温度的升高而下降；酚类物质和黄酮类在温度小于50℃时随温度增加而增加；用DPPH法和氧化自由基吸收能力（ORAC）法测定了抗氧化剂活性，ORAC法在40℃时达最高，与酚类物质和黄酮类含量有较好的相关性。当温度达到50℃以上时，8种天然甜味剂中除了Stb外7种成分含量增加了，在温度60～80℃甜味剂增加不显著[12]。使用100℃和180℃的热风干燥、冷冻干燥和阴凉干燥的不同干燥条件，对甜菊叶中甜菊糖（St、Dul A、Reb A和Reb C）和抗氧化剂进行评估。St是鲜叶的主要糖苷，含量81.2mg/g，在任何情况下都会降低，虽然阴凉干燥是最好的处理。考虑到抗氧化参数（总酚类、黄酮类和总抗氧化剂），最合适的热风干燥法在180℃，因为大大增加了没食子酸、儿茶素和羧酸含量（分别为76.8、45.1、126mg/g甜菊），在鲜叶的含量分别为44.4、2.5和52.9mg/g甜菊。因此，理想的甜菊叶干燥法取决于他们最终的用途（甜味剂或抗氧化剂），尽管如此，在180℃的热风处理法是最值得推荐的[13]。

SGs具有甜味和生物活性，然而除了主要糖苷外，提取物中还有能有助其活性的其他苷，因此对其量化是重要的。用HPLC-UV法来测定Dul A、Stb、Reb C和Reb B，结果：校正曲线的线性工作范围为25～150μg/ mL，相关系数≥0.99，测定系数≥0.98；检测限（LOD）为5.68～8.81μg/mL，量化限（LOQ）为17.21～26.69μg/mL；回收率为100%±10%，精度、相对标准偏差＜10%。该方法验证了准确性、线性度和精度，因此可应用于甜菊叶小SGs的定量分析[14]。用UHPLC-UV方法对甜菊产品的葡萄糖进行定量测定。St产品与苯基吡唑酮（PMP）反应后，分析PMP衍生品发现35个产品至少有7个含有0.3%～91.5%（w/w）的葡萄糖，其中SPR-12和SPR-27分别表现出61.6%和91.5%的高葡萄糖含量。此外，UHPLC-UV-ELSD法用于定量测定甜菊及相关产品的Reb A、St、Reb D、Dul A和Stb。运行12min，基线分离了5个SGs，LOD和LOQ分别小于10和30μg/mL，再现性小于2.5%，回收率为90%～94%；葡萄糖的PMP衍生物LOD和LOQ分别为0.01和0.05μg/mL，再现性小于2.6%，回收率为-101.7%～98.6%。该方法可用于甜菊和SGs甜菊产品的鉴定、质量保证和掺杂物评估[15]。

对欧洲8个地区、7个不同的甜菊品种种植2年以上、1年收获3次的总共166个甜菊样本的绿原酸和总黄酮苷进行分析和量化。化合物的量化包括绿原酸、类黄酮苷和糖苷配基。所有酚浓度分布剖面图表现为完美的高斯分布，所有的绿原酸浓度显示为正相关，而黄酮苷却没有相关性[16]。

3 甜菊的培养基、分子生物学、转基因研究

绿原酸及其衍生物（CADs）是有益于健康的生物活性植物次生代谢产物。进行了甜菊毛状根培养，并优化了生产CADs的培养条件研究。由甜菊叶和农杆菌（Agrobacterium rhizogenes，C58C1）侵染后共培养诱导毛状根，进行rolB和rolC基因的PCR检测验证。HPLC-MS和HPLC分析表明，绿原酸[3-咖啡酰奎宁酸（3-CQA），3，5-二咖啡酰奎宁酸（3，5-CQA）和4，5-二咖啡酰奎宁酸（4，5-CQA）]是毛根中主要的CADs。选择8个快速生长的单根，其中，T3的CADs收益率最高；添加40 g/L蔗糖的B5培养基比其他培养基更适于生产CADs，在最佳培养条件下，这3个化合物的总含量达到105.58mg/g，总收率为234.40mg/100mL[17]。

观察了甜菊经脯氨酸和聚乙二醇（PEG）处理其愈伤组织和悬浮培养SGs的产量增加情况。为研究其效果，从甜菊叶片获得黄绿色紧凑的愈伤组织，在MS培养基上添加2.0mg/L NAA和不同浓度的脯氨酸（2.5～10mm）与PEG（2.5%～10%），在24±1℃和22.4μmol/（m2·s）的光强度（白色荧光管16 h）进行继代培养2周。结果在5mM脯氨酸和5%PEG的浓度，愈伤组织和悬浮培养生物量（即新鲜和干重含量）增加了，如果继续增加浓度，它们却降低了。在用诱导子处理/不处理两种情况下对愈伤组织（第15天收集）和悬浮培养（第10和15天收集）的SGs含量进一步做HPLC分析，观察到化学作用显著增强了SGs的生产。在添加7.5mm脯氨酸和5%PEG时，愈伤组织SGs含量分别从0.27%（对照）增加到1.09%和1.83%，约是对照的4.0和7.0倍。然而，在悬浮培养的情况下，相同的脯氨酸和PEG浓度使SGs含量在第10天分别从1.36（对照）增加到5.03%和6.38%，是对照的3.7倍和4.7倍[18]。

甜菊产物半日花烷型二萜也可由SGs分离出来，然而，在叶片组织中，其生物合成途径和空间分布还不清楚。组织特异化学分析表明SGs累积在叶片细胞中而不是表皮毛中；甜菊表皮毛中含有半日花烷型二萜，如氧代泪柏醚、树脂中含贝壳杉醇酸。系统发育和基因表达分析明确了特定基因在2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸编码酶和甜菊醇或其它半日花烷型二萜的生物合成。此外，RNA序列分析揭示了柯巴基焦磷酸合酶（CPPS）、贝壳杉烯合酶1（KS1）同系物；柯巴基焦磷酸合酶2（CPPS2）和类贝壳杉烯合酶（KSL）在表皮毛中表达；体外和植株内测定表明CPPS和KS1是不同的；CPPS2依次催化KSL组合中的泪柏醚和上泪柏醚。结论表明，甜菊叶片组织进化到使用不同的代谢途径以避免代谢干扰来产生不同的次级代谢产物[19]。

接种丛枝菌根真菌（AMF）建立和增强SGs生产，比较了在SGs生物合成途径的3个阶段11个关键基因的转录资料。转录分析显示菌根（M）植物的基因编码2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径酶，即1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸-羟酸还原异构酶（DXR）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2，4-焦环磷酸合成酶（MDS）的负转录调控。锌和锰对MDS的表达是必需的，提高M植物的吸收可能会增强MDS的转录。在第二阶段的SGs生物合成途径，菌根化增强了CPPS和异贝壳杉烯酸羟化酶（KAH）的转录，这个表达对SGs的生物合成是决定性的，CPPS调节对异贝壳杉烯前体的合成前体代谢流量，KAH指导这些甜菊醇代替赤霉素合成。第三阶段，通过4个特定的尿苷二磷酸 （UDP）依赖糖基转移酶（UGTs）指令使甜菊醇葡糖基化为Reb A。M植株3个特异的UGTs更高的转录水平可以解释SGs增强生产，同时UGT76G1转录水平就越高，尤其Reb A/St比率提高，可以使甜味增加。此研究表明AM共生上调了所有SGs生物合成基因的转录，由于增强了M植物的光合作用致使营养改善和糖浓度增加[20]。

植物生长和次生代谢通常由外部因素如光、温度和水来调节。测定了高低温、脱水、光周期、不同生长阶段的变化对甜菊的SGs含量和15个参与SGs生物合成基因的转录水平的影响。结果显示，所有15个基因的转录水平在低于25℃处理下达最大，在低温（15℃）和高温（35℃）下，SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrIDI、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1的转录受到抑制。大多数基因在SGs生物合成途径呈现脱水下调。在生长阶段，SGs的含量有明显的变化，在快速生长时期15个基因的转录水平是最小的，在现蕾阶段和开花阶段表现出明显的增加。结果说明，环境因素对SGs含量的影响和相应的生物合成基因的转录是显著的，值得深入研究[21]。

miRNAs正在成为潜在的基因表达的调节器，在调节相关基因网络的生物合成途径起重要作用，掌握这些途径基因调控的关键，可能协助选择和操纵得到高效植物基因型（含有更好的次生代谢物产量和增加生物量）。miRNAs与SGs生物合成途径的基因有关，却没有被识别。本研究中，SGs生物合成途径的目标miRNAs基因首次被识别，其前体可能由来自甜菊的ESTs和核苷酸序列产生，调查证明了所有的miRNAs在3个组织：叶、花和茎的表达不同。11个miRNAs验证中，9个miRNAs（miR319a、miR319b、miR319c、miR319d、miR319e、miR319f、miR319h、miRstv_7、miRstv_9）的表达水平是反相关，而miR319g和miRstv_11的表达水平除外，表明叶、花和茎中目标miRNAs的表达水平与SGs含量有直接关系。本研究可更好地理解SGs生物合成途径，这些miRNAs进一步可以用来操纵这些代谢产物的生物合成以增强甜菊的含量和产量[22]。

测定了拟南芥（Arabidopsis thaliana）对甜菊SrKA13H（贝壳杉烯酸-13羟化酶）cDNA的异位表达。HPLC分析显示了在两个独立的转基因拟南芥品系过度表达SrKA13H使甜菊醇含量（1～3μg/g DW）显著增加。甜菊醇浓度检测显示，两个转基因品系的内源性生物活性赤霉素（GA1和GA4）均减少，它们具有赤霉素缺乏突变体的表型相似性；减少内源赤霉素含量出现转基因侏儒症，外源GA3的应用可以拯救转基因侏儒症。在转基因中下胚轴、丛生区和茎秆长都大大减少。花粉活力下降了，60%～80%的花粉萌发受阻，转基因植株的种子产量降低了24%～48%。甜菊醇的外源性应用（0.2、0.5和0.2μg/mL）不影响花粉萌发率。在转基因拟南芥中甜菊醇的植株形成没有变化[23]。

贝壳杉烯做为专用前体池负责SGs等天然甜味剂的合成。本研究中，为在大肠杆菌中生产贝壳杉烯，从甜菊中模块化构建和表达两个贝壳杉烯基因编码CPPS和贝壳杉烯合成酶（KS），称为典型植物生产SGs。甜菊的CPPS和KS功能在不同的宿主大肠杆菌（E.coli）中表达。此外，为了提高大肠杆菌中贝壳杉烯的生产，通过测量贝壳杉烯的生产，比较了来自各种微生物和8株大肠杆菌 （E.coli）的6个香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）。贝壳杉烯最高产量大约41.1 mg/L，是大肠杆菌菌株MG1655共表达合成CPPS-KS模块和来自类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的GGPPS。经大肠杆菌（E.coli）的类异戊二烯前体的3个关键酶[DXS、法呢基焦磷酸合酶（IspA）、异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）]的过度表达，贝壳杉烯生产进一步增加到179.6 mg/L。最后，在1 L含20 g/L甘油的生物反应器中通过培养大肠杆菌菌株MG1655共表达贝壳杉烯模块、DXS、IDI和IspA，贝壳杉烯达到最高的滴定度（578 mg/L）时贝壳杉烯特定的收益率是143.5mg/g DW细胞[24]。

Napolitano JG等进行了数字核磁共振作为构建块，组装SGs的1H指纹研究[25]。Sadeghi B等使用甜菊叶中提取物将金离子还原成纳米粒子的可行性进行了研究[26]。金纳米粒子具有不同的技术特性，如紫外可见光谱、红外光谱、X射线衍射（XRD）、扫描电镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）。TEM实验表明，这些纳米粒子是球形和均匀分布，其大小为5～20nm；红外光谱表明，金纳米粒子携带功能化的生物分子，伯胺团（NH2）、羰基团、OH团和其他稳定的功能团；X射线衍射模式显示，金纳米粒子的高纯度及面心立方结构大小为17nm；SEM表明形成了金纳米粒子。

4 甜菊的营养与保健功能、食品开发及医疗作用

对健康白种人和亚洲人采用体外人粪便匀浆，对SGs的Reb A和Reb E的水解作用，以及由Stb至甜菊醇的代谢进行了评价。两组测试中每种莱鲍迪苷的潜伏导致甜菊醇的快速水解。在24 h内完成了0.2 mg/mL样品的代谢，大多数发生在第一个16 h，与对照Reb A比较，Reb E代谢程度和比率没有明显的差异，含0.2 mg/mL的Reb A和Reb E水解样品往往略超过0.2 mg/mL样品。不管测试浓度如何，Reb A或Reb E在新陈代谢速度上没有明显的性别或种族差异。Reb E到甜菊醇水解的中间物Stb也迅速被分解。这些结果表明Reb E代谢为甜菊醇与Reb A的方式相同，SGs被代谢为甜菊醇（即Reb A）等数据说明了Reb E是安全的[27]。在进行的甜菊甜味剂消费和大学生的营养状况的关系研究中，对4个智利大学的486个一年级大学生进行评估，对每个学生每周含有甜菊的食物和饮料进行测定。结果：69.8%的学生每周消费甜菊，摄入的甜菊81.2%为液态膳食，只有1.4%的学生超过了容许日摄入量（ADI），正常体重女性比肥胖或超重者显示更高的甜菊摄入量。最后，甜菊消费与正常体重第一个模型和第二模型呈正相关。结论：甜菊消费与智利大学生正常营养状况呈正相关[28]。

小麦功能面包中的蔗糖由不同水平的甜菊提取物替代，与传统的小麦面包进行相比。通过α-淀粉酶和α-葡糖苷酶测定得知葡萄糖的摄入明显减少了，其IC50分别为198.40 μg/mL和596.77 μg/mL，自由基清除能力表明IC50=335.94 mg/mL。与对照组相比，在保质期甜菊提取物的面包是柔软的，并且微生物生长较低；感官试验表明，甜菊提取替代50%时其质量特征更容易被接受，甜菊提取物面包的膳食纤维含量较高，而消化的碳水化合物较低，因此热量摄入明显减少。结果表明，在面包的制作过程中甜菊提取物的生物属性被保留，此种面包可能成为适合人类营养的功能性食品[29-30]。

植物浸剂有益于健康，是由于它们含有生物活性物质。然而，这些物质在加工和存储过程中很容易被降解。洛神葵（Hibiscus sabdariffa L.）的多酚化合物的最佳提取条件是95℃/60min。甜菊的加入增强了该饮料存储期间色彩和一些多酚的稳定性，如槲皮素、没食子酸和迷迭香酸。此外，甜菊降低了ABTS、DPPH活性和α-淀粉酶抑制能力，而柠檬酸却没有这个效果。这些结果可有助于改善低热量和功能性饮料的工艺流程[31]。

甜菊叶中主要含有SGs，但也有重要的抗氧化物（维生素C、多酚类物质、叶绿素及类胡萝卜素）和其他重要大量和微量元素，如叶酸和所有的必需氨基酸（色氨酸除外）。今后需要获得更环保、可持续和可行的过程导引食品行业和食品科学家开发新流程完全符合绿色开采的理念[32]。

通过ORAC和细胞抗氧化活性（CAA）化验，叶子提取物抗氧化活性高于茎。与植物提取物相比，甜菊叶的主要甜味代谢物St和Reb A，表现出较低的ORAC，而没有引起任何CAA，甜菊没有表现出对人类细胞（肝癌细胞）HepG2的毒性，用这些提取物处理细胞，没有观察到细胞治疗增生性和过氧化氢酶调节等。因此甜菊除了它的甜味，可以作为抗氧化剂的来源，甚至在胞内水平起作用[33]。

甜菊叶片提取物无毒，其生物活性表现在与治疗糖尿病、防龋齿、抗氧化、调节低血压、降高血压、抗菌、抗发炎、抗肿瘤等有关，预防和治疗代谢紊乱[34-35]。

身体组织对胰岛素不能完全响应与细胞膜胰岛素受体有关，胰岛素的捆绑到受体在靶细胞表面（增强细胞对葡萄糖的吸收）诱导使高亲和力的葡萄糖转运体分子增加。世界卫生组织（WHO）专家委员会推荐的从植物源方面探讨血糖过低的重要性，用于传统医学治疗糖尿病。从甜菊中提取的St和二萜糖苷作为抗高血糖剂用于治疗糖尿病已有几十年。在转录水平、蛋白质水平和通过测量细胞葡萄糖吸收的体外细胞系研究，明确St和甜菊醇诱导葡萄糖吸收的功效。结果：经qPCR测定GLUT4基因的绝对和相对量显示，GLUT4转录活化发生在3T3-L1脂肪细胞和L6肌管的甜菊醇的较低浓度（1μM）和St的较高浓度（100μM）。在两种细胞系中使用相同的甜菊醇浓度和St，GLUT4蛋白和葡萄糖吸收水平的增加说明：甜菊醇和St与胰岛素在两种细胞系控制血糖水平功能是相似的。换句话说，St和甜菊醇的拟胰岛素特性是明显的[36]。最近脂肪因子在糖尿病发病率的关系作用已被证实。用于治疗糖尿病的药用植物之一是甜菊。在被诱发糖尿病的大鼠作为新的脂肪细胞因子调查甜菊对血清网膜素和内脏脂肪素水平的影响，找到潜在的甜菊的抗高血糖的影响机制。40个体重180～250g的雄性大鼠被腹腔注射链脲霉素（STZ）诱发患糖尿病，被分成5组，每组8只，第1组（非糖尿病对照）和第2组（糖尿病对照）用蒸馏水处理；在治疗组，第3组（T250）、第4组（T500）和第5组（T750），每天上午9时分别喂食250、500和750mg/kg的甜菊。在研究结束时，第3组和第4组的空腹血糖（FBS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、甘油三酯（TG）、碱性磷酸酶（ALP）和网膜素比第2组显著降低了，甜菊提取物没有引起β细胞数量的增加。结论：250和500mg/（kg·d）的甜菊剂量对STZ诱发糖尿病的大鼠通过激活胰岛素敏感性降低网膜素水平和血糖[37]。2型糖尿病、肥胖和肝脏疾病是密切交互影响的。对缺乏对待ob/ ob和双重低密度脂蛋白受体（LDLR-double）的小鼠饲喂10mg/（kg·d）St、12mg/（kg·d）Reb A，或5mg/（kg·d）甜菊醇，测定其对肝脂肪变性和脂毒性代谢的影响。结果所有物质减弱了肝脂肪变性，这可以解释为改善了葡萄糖代谢、脂肪分解代谢、胆汁酸代谢和脂质存储与运输。推断：甜菊衍生物将肝脂肪变性降低到一定程序，肝脏毒性可通过一些病理生理变化而降低[38]。

甜菊醇葡糖苷酸（Steviol glucuronide，SVG）是来自甜菊醇、St和Reb A的糖苷配基的主要代谢物，当摄入St和Reb A后，生成SVG被排泄到尿液中。结果表明，SVG不是流出转运体BCRP、MRP2、MATE1或P-gp的基质，与OATP1B1、OATP1B3或OATP2B1相比，有机阴离子转运蛋白3（OAT3）在SVG吸收中起重要作用。槲皮素、替米沙坦、双氯芬酸和桑皮黄素抑制OAT3调解IC50值为1.8、2.9、8.0和10.0μM的SVG的吸收。因为OAT3是肾的主要吸收转运体，使用药物和甜菊叶提取物使OAT3活动受到抑制可能改变SVG的肾清除[39]。

研究了SGs及其第一阶段的一些代谢物在癫痫动物模拟最大电休克发作（MES）测试中作为潜在的抗惊厥癫痫剂是有效的，证实存在剂量依赖性抗惊厥的作用。分离出的St和Reb A用于MES测试，表现为阳性。说明了在食物成分和天然产品中找到新的功能和治疗适应症的可能性[40]。

5 外界环境因素对甜菊的影响

SGs和GA3有共同的生物合成途径。对外源GA3和丁酰肼（赤霉素抑制剂）对甜菊生长和代谢产物的影响进行试验。结果表明，GA3显著增加甜菊的茎长度和茎干重，外源GA3施用在甜菊叶，使甜菊总可溶性糖含量增加而SGs生物合成减少。在另一项试验中，丁酰肼喷施于甜菊嫩枝，其茎秆长度减少了，丁酰肼在30× 10-4%浓度不影响总SGs含量，显著增加甜菊叶可溶性糖产量。虽然甜菊的赤霉素生物合成途径最初是旺盛的，但是外部GA3对甜菊内部赤霉素的生物合成有高精度调节作用，说明甜菊能够使内源赤霉素保持在低数量而不影响SGs的生产。此外，假设甜菊叶内部赤霉素被丁酰肼破坏，丁酰肼不足对SGs产量的影响中赤霉素生物合成不是主竞争因子[41]。用120个甜菊叶样本研究了农业措施中生长光化异构化的相关性，测定了叶样品的绿原酸顺式反式比率、气候和收获的相关性，结果显示顺式咖啡酰氧基衍生品和收获前日晒时间有明显的相关性，说明适当的紫外线照射植株影响其植物的化学成分[42]。

甜菊在发育阶段对低温敏感，寒冷胁迫与用内源性信号组件预处理，特别是水杨酸、过氧化氢、6-苄氨基嘌呤和氯化钙处理可以诱导对寒冷的耐受性[43]。在露天盆栽条件下，测试5个施N量和3次收获对甜菊叶黄酮类成分和抗氧化性的影响。结果表明，在适量施N和适当的收获时间，可以显著提高和优化生物活性物质的水平，特别测定了150kg/hm2N的高Reb A/St比、总酚类和黄酮类化合物、木樨草苷、芹菜甙元水平和抗氧化能力；与150kg/hm2N比，减少或增加N量对甜菊化学物质含量均没有影响。St和黄酮类化合物之间存在显著的相关性，表明黄酮类在St代谢途径可能起作用，有待深入研究[44]。研究了叶片N浓度、CO2同化、叶片产量和SGs之间的关系。两个基因型在生长室（CC：控制条件），在温室（SCC：半控制条件）和大田条件（FC）进行了连续试验。在CC和SCC下，应用3个施N水平；FC试验，植物被种植在4个地点。结果N供应（CC和SCC）和地点（FC）对叶片N含量有显著的影响；当光不限制（SCC和FC）叶片N含量时，CO2同化速率与生物量积累呈正相关；不考虑生长条件，叶片N含量与SGs含量呈负相关。然而，增加SGs含量与Reb A/St的比率下降相关。表明，增加SGs积累对生物质生产有负面影响，建议要提高植株SGs的生产力要相对减少施肥[45]。植物营养和气候条件对甜菊的生长和次生代谢物起重要作用；然而，营养剂受生长地区土壤性质和气候条件强烈的影响。在印度北部进行了三水平氮、二水平磷和三水平钾的田间试验，结果：主成分分析（PCA）表明：根据CSIR-IHBT（科学和工业研究理事会-喜马拉雅生物资源技术研究所）和RHRS（地区园艺研究站）地区的干燥叶产量，确定每公顷90kg N、40kg P2O5和40kg K2O是最好的农业营养条件；空间变异性对叶产量和St含量也有相当大的影响。在3个地方，CSIR-IHBT最适合于干叶产量和叶中次生代谢产物积累。表明干燥叶产量和St的积累受控于环境因素和农艺管理；而Reb A的积累受这两个因素的影响不大。因此，甜菊叶产量和次生代谢产物可以通过选择适当的生长地和适当的营养管理得到改善[46]。

为了解内生细菌、植物生长、叶面喷施富啡酸之间的相互作用，从不同生长阶段的甜菊叶（富啡酸和无富啡酸两种处理）提取宏基因组DNA，甜菊叶内生细菌的多样性通过16S rRNA基因的焦磷酸测序估算。结果，不管何生长阶段和是否有富啡酸应用， 变形菌 （Proteobacteria）、 放线菌 （Actinobacteria）、 拟杆菌（Bacteroidetes）和厚壁菌（Firmicutes）是占主导地位的菌群。甜菊生长阶段强力调控内寄生菌群的成分。在苗期农杆菌属（Agrobacterium）、欧文氏菌（Erwinia）占主导，分别达12.3%和7.2%，在繁茂期和始花期却明显下降，而在收获季节成熟叶中鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）和甲基杆菌属（Methylobacterium）增加了，二者构成核心内生菌群的重要组成部分，分别与St含量和UGT74G1基因表达呈正相关；而欧文氏菌、农杆菌属和芽孢杆菌属与St积累呈负相关。富啡酸处理加速了生长阶段内生菌的变化和增加了SGs含量[47]。

6 甜味及其改良

通过构造人类甜味受体的同源模型T1R2和T1R3子单元，来对接研究甜菊天然甜味剂。SGs的对接结果，与文献中可用的数据显著相关，能预测SGs精确的甜味等级次序。绑定模式表明，T1R2的主要氨基酸残基：天冬酰胺44、天冬酰胺52、丙氨酸345、脯氨酸343、异亮氨酸352、甘氨酸346、甘氨酸47、丙氨酸354、丝氨酸336、苏氨酸326和丝氨酸329，与T1R3的主要氨基酸残基：精氨酸56、谷氨酸105、天冬氨酸215、天冬氨酸216、谷氨酸148、天冬氨酸258、赖氨酸255、丝氨酸104、谷氨酸217、亮氨酸51和精氨酸52，分别相互影响。氨基酸与SGs的相互作用主要是通过与葡萄糖的羟基团形成氢键。在SGs所有的对接构成中发现显著的变化，各种SGs不同的捆绑模式及其结构特点形成多个点的刺激模型，这就是SGs的甜味机制。使我们进一步认识了解味道的差异，使用半合成的办法改善SGs的味道[48]。

研究了高效酶改性体系提高St的口味质量。环糊精葡聚糖转移酶 （CGTase）产生的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp）菌株CGMCC5316，是从甜菊种植土壤中分离出来的。以淀粉为糖基供体，CGTase可以将St转化为一个特殊产物——Reb A的异构体 （可由单糖基化St识别），St的味道明显地被生成的单糖基化St改善了，具有类似蔗糖品味，其甜味显著增加了35.4%。对影响CGTase的因素进行优化后，与初始条件相比，在3.9 g/L淀粉、17.9 g/L胰蛋白胨和67.6 h培养时间的最优条件下，优化后的CGTase活性增加了214.7%，St的转糖基作用速率显著提高了284.8%，达到了85.6%。这个CGTase修饰系统为改善甜味和St的口味质量提供了一种很有前途的解决方案，CGTase转化效率可极大提高Paenibacillus sp.CGMCC 5316培养条件的优化[49]。

Reb A具有理想的甜味，而St产生残余苦味。从St到Reb A的酶合成能增加SGs中Reb A/St比率。通过甜菊的UDP-葡糖基转移酶UGT76G1和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的蔗糖合成酶AtSUS1活性重组，证明St到Reb A的高效转化。通过AtSUS1使得UDP-葡萄糖再生发生了转化。UDP是UDP-葡萄糖的初始物执行UDP-葡萄糖再循环，在反应混合物中UDP的数量可以大大降低。在2.4mM St，7.2mM蔗糖，0.006mM UDP条件下30 h，Reb A的产量是78%[50]。Reb A是合适的满足消费者需求的甜味剂，但在高浓下有不良的口味。研究中，创建一个模拟饮料（冰红茶），将含有20%和40%蔗糖样品由Reb A替代，来确定消费者所能接受的最佳感觉。结果分别显示非常相似的感觉，但与冰红茶相比有明显高的一些风味属性，如人造甜味，类似甘草和金属味，以及甜苦的余味，与对照比含有Reb A的样品受到偏爱和接纳。鉴于此研究结果，用Reb A替代20%或40%蔗糖的冰红茶是切实可行的[51]。

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Review of Foreign Stevia Research in 2015

LIU Na1,2,LI Hong-xia1,2,ZHANG Wen-bin1,HU Xiao-hang1,2,3*
(1.Institute for Crop Research，Heilongjiang University/Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China；2.The Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080,China;3.Laboratory of Quality＆Safety Risk Assessment for Sugar Crops Products(Harbin),Ministry of Agriculture,P.R China,Harbin 150080)

The research progress abroad of Stevia and its extractive in the English literature in 2015 was reviewed,so as to provide the references for the research and development of Stevia in China.

Stevia;extractive;stevioside;rebaudioside;review

S566.9

B

1007－2624（2017）01－0057－08

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.019

2016-06-05

刘 娜（1974-），女，黑龙江通河人，助理研究员，主要从事甜菜生理学和栽培学研究。E-mail：ln5-8@163.com

胡晓航（1980-），女，黑龙江省哈尔滨人，助理研究员，博士，从事糖料产品风险评估研究，Email：hxhlmz@163.com