物理信号调控间充质干细胞行为的研究进展

姚生莲王秀梅王鲁宁

物理信号调控间充质干细胞行为的研究进展

姚生莲1,2王秀梅2王鲁宁1

间充质干细胞由于其多能分化性、易于获取、致瘤风险低和伦理争议少等特点已经成为组织工程和再生医学研究理想的细胞来源。但是在干细胞治疗和组织再生修复过程中，干细胞的使用仍然存在着诸多问题，例如干细胞在体内的迁移和分化等行为的不确定性为干细胞的应用带来了一定的风险。近年来，设计生物材料调控干细胞行为命运受到了越来越广泛的认可和关注。通过生物材料的参数设计实现生物物理和生物化学信号的可控递送，达到调控干细胞行为和生理功能的目的，为干细胞的应用提供了理论基础。本综述将重点介绍各类生物物理信号如拓扑结构、力学信号以及电信号等对干细胞的调控作用及相关机理，为干细胞的应用以及生物材料的设计提供重要思路。

间质干细胞； 信号传导； 调控； 综述

干细胞是一类具有自我更新和多能分化潜能的细胞，在一定条件下，可以分化为多种功能细胞和形成各类组织器官。因此，利用干细胞的这些特性，将干细胞移植到体内实现受损细胞或组织的修复和再生已成为一种崭新的生物治疗方法，即干细胞治疗[1]。与此同时，干细胞在组织工程和再生医学领域中的应用和突出贡献也引起了越来越广泛的关注[2]。其中，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源广泛，可从脂肪、骨髓、血液以及脐带中大量获取，这为干细胞治疗提供了充足的细胞保障。同时，MSCs具有免疫原性低，分化潜能大等优点，因此，MSCs成为目前研究最为成熟，应用最为广泛的干细胞类型[2-3]。

在干细胞治疗和组织工程与再生医学研究中，对干细胞功能的精准调控成为了干细胞临床应用的关键问题。例如，对移植干细胞的靶向递送、归巢及其行为调控是实现干细胞有效修复和再生组织、且确保治疗安全性的前提。即便是通过生物材料募集内源性干细胞，仍然需要通过激活干细胞特异性的细胞响应和应答反应，来实现组织再生修复。细胞作为组织工程的三大基本要素之一，与生物框架材料、调控因子相互作用，促进组织的修复和再生。近年来的研究表明，生物框架材料的作用不再是简单的载体，同时起到“干细胞微环境”的作用，通过材料递送各类信号，调控干细胞的功能。而要实现对干细胞的定向调控，可以设计生物材料模拟干细胞在体内的微环境。干细胞在体内环境下，周围细胞外基质的物理、化学性质以及生物活性分子均起到干细胞调控信号的作用，调控着干细胞的行为命运。因此，近年来，设计生物材料调控干细胞行为命运受到了越来越广泛的认可和关注[4-5]。通过生物材料的参数设计实现其可控递送各类生物物理和生物化学信号，达到调控干细胞行为和生理功能的目的，为干细胞的应用提供了理论基础和指导作用。本综述将重点介绍各类生物物理信号如拓扑结构、力学信号以及电信号等对干细胞的调控作用及相关机理。

一、拓扑结构对干细胞的调控

（一）取向结构对干细胞的调控

取向结构作为一个重要的物理信号对干细胞的黏附，迁移，分化等具有调控作用。众所周知，诸多天然组织如神经、肌肉、肌腱和韧带等都具有取向性结构特点。而这样的结构特点与组织特定的生理功能密不可分。这些组织中细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的取向排列不仅增加了组织的力学性能，还增强了细胞间的相互通讯。在体外情况下，取向结构可以快速诱导干细胞定向黏附，并且引导干细胞的骨架沿着取向结构的长轴方向拉伸，使得干细胞的形貌具有较高的长径比[6-7]。例如，利用静电纺丝技术可以便捷的制备出具有纳米取向结构的高分子薄膜。有研究表明在电纺制备的具有取向结构的聚己内酯薄膜上，大鼠MSCs的nestin，tubulin βⅢ和map2的表达均高于无序结构的薄膜，说明了具有取向结构的纤维可以促进MSCs的神经分化[8]。

不仅是二维的取向结构，三维取向材料对干细胞的分化也表现出有效的调控作用。相比于具有二维取向结构的薄膜材料，三维取向结构的材料更接近天然细胞外基质的三维环境，为干细胞提供更接近体内的三维生长环境。例如，美国西北大学Stupp课题组[9]采用两亲多肽分子（peptide amphiphile，PA）自组装形成具有取向结构的水凝胶。该水凝胶可以诱导神经前体细胞（neural progenitor cells，NPCs）向神经元分化。清华大学王秀梅课题组利用旋转液态接收静电纺丝装置制备出具有取向结构的纤维蛋白水凝胶。该水凝胶具有的取向结构可以诱导MSCs向神经方向分化[6]。

（二）微图案对干细胞的调控

细胞与材料的界面识别对细胞的功能具有重要影响。通过对材料表面微图案化设计，作用于单个细胞，可直接影响细胞形态形貌，进而对其功能有显著的调控作用。近些年来，采用光刻蚀或者喷墨打印等方式可以在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）等水凝胶的表面制备出各种形状的微图案用于研究材料的拓扑结构对干细胞的调控作用。例如，复旦大学丁建东课题组在PEG水凝胶的表面构建出尺寸为400 ～ 2500 μm的方形微图案。研究的结果发现尺寸为900 μm的微图案最有利于单个大鼠MSCs的黏附[10]。进一步采用光刻蚀的方法在PEG的水凝胶表面制备出了圆形、方形、三角形和星形的等轴状微图案，研究干细胞形状与细胞调控。由于是单细胞培养，所以可以控制MSCs的黏附形貌与设计的形状一致，分别呈等轴状的圆形、方形、三角形和星形。研究表明，MSCs的黏附形貌不同会对其分化产生影响。同样的成骨诱导或者成脂诱导的培养条件下，MSCs成骨分化的程度和成脂分化程度分别是星形和圆形的最高[11]。不仅形状不同的等轴状微图案会调控MSCs的成骨和成脂分化，同样是矩形的情况下，微图案的长径比也会影响干细胞的黏附从而调控干细胞的分化行为。例如在长径比分别为1，2，4，8，16的微图案上，单个MSCs由于受微图案的约束，形成相应长径比的黏附形态。结果表明，MSCs的黏附长径比为2时，成骨分化最为显著，表现为碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表达量最高。而MSCs的长径比为1时，其成脂分化最为显著[12]。

微图案模型可以在单个细胞的尺度上实现对干细胞行为的调控，是一种非常理想的研究材料微观结构对干细胞调控作用的手段。对于微图案对MSCs成骨分化的调控机制，目前主要认为是微图案可以影响细胞的张力，从而调控其分化行为。丁建东课题组采用细胞细胞骨架的抑制剂在不影响细胞形状的情况下干扰细胞的张力，证明了细胞骨架在MSCs成骨分化的过程必不可少，而且主要是通过ROCK信号通路实现成骨分化的调控。而该信号通路对MSCs成脂分化的影响则并不明确[12]。

（三）其他表面结构对干细胞的调控

生物植入体的表面结构在很大程度上决定了其植入体内后与周围组织的整合情况，因此植入体表面结构的设计具有非常重要的意义。例如在钛种植体的表面通过阳极氧化的方式制备出一层具有纳米结构的二氧化钛纳米管结构可以促进MSCs的黏附、增殖以及成骨分化[13-14]。而且钛纳米管的尺寸大小对MSCs还具有调控作用，Oh等[15]研究表明，在未添加化学诱导因子的条件下，小尺寸的钛纳米管有利于干细胞的黏附，而大尺寸的钛纳米管表面具有诱导MSCs成骨分化的作用。二氧化钛纳米管表面的结构信号对干细胞的调控作用主要是基于其对环境中蛋白质的吸附，进一步决定了干细胞的黏附情况，从而实现对干细胞的调控。小尺寸钛纳米管上细胞外基质蛋白沉积的密度较高，为细胞的黏附提供了更多的位点，因此可以促进细胞的黏附[16]。而大尺寸钛纳米管上细胞外基质沉积的密度较低，细胞为了寻找黏附的位点需要进一步拉伸伪足，改变细胞的骨架结构，从而实现成骨细胞分化。而且大尺寸的钛纳米管表面的表面能相对较高，也不利于干细胞的黏附。

二、力学信号对干细胞的调控

（一）弹性模量的调控作用

体内干细胞所在微环境的细胞外基质在不同组织中千差万别，具有不同弹性模量。例如弹性模量最低的脑组织的弹性模量只有0.5 ～ 1 kPa左右；而骨组织的弹性模量达到100 kPa以上[17-18]。在体外研究表明，具有不同弹性模量的基底对MSCs的黏附和分化具有调控作用。Engler等[18]研究发现，基底的弹性模量在0.1 ～ 1 kPa时，可以诱导MSCs向神经细胞分化；当弹性模量为8 ～ 17 kPa时，可以诱导MSCs表达肌肉细胞的特异性蛋白；而当基底的弹性模量高于30 kPa时，MSCs表现出成骨分化的特性。类似的，将MSCs在弹性模量为1 ～ 15 kPa的二维水凝胶表面培养时，MSCs在低弹性模量的表面表现出向成脂和成软骨分化，而在高弹性模量的表面，MSCs则倾向于成骨分化[19]。

在具有不同弹性模量的二维水凝胶表面上，MSCs除了表现出分化存在差异外，细胞的黏附形貌也具有较大的差异[17-19]。而在三维的不同弹性模量的培养基底上，虽然细胞的黏附形貌均表现为球形，但是不同的弹性模量依然对MSCs的分化具有调控作用[20-22]。例如Huebsch等[20]在三维的海藻酸钠水凝胶内培养MSCs时发现，在2.5 ～ 110 kPa之间低弹性模量的基底更有利于MSCs向成脂分化，而高弹性模量的基底会诱导MSCs向成骨分化。Huebsch等[23]课题组采用具有不同弹性模量且带有孔洞的水凝胶作为MSCs的载体植入到体内，研究发现相对于5 kPa弹性模量的水凝胶，弹性模量达到60 kPa的水凝胶在体内对干细胞诱导成骨活性最好。无论是在二维还是三维的培养条件下，基底的弹性模量对MSCs的分化都具有调控作用。而且与体内组织具有相似弹性模量的基底可以诱导MSCs向对应的细胞类型分化[18,24]。

（二）外加应力的调控作用

除了干细胞所在基质的弹性模量对其具有调控作用外，外在的力学信号例如液体的流动产生的剪切力，外加的压应力以及拉伸力等均对干细胞的分化产生影响。其中液体流动产生的切应力被证明可以提高MSCs的成骨分化能力。例如Filipowska等[25]将MSCs培养在包被了明胶的三维多孔聚氨酯支架上，并以2.5 ml/min的流速注入培养基，实现三维培养条件下切应力对MSCs的调控。研究表明培养基流动产生的切应力不仅可以提高MSCs的增殖，同时还促进了其成骨分化。同样的，外界施加的压应力可以促进MSCs向软骨细胞分化。研究表明，在三维培养的MSCs水凝胶上以1 Hz的频率加载10﹪的应变力，每天加载4 h，14 d后发现周期性压应力的加载有利于MSCs成软骨分化。而且通过外加压应力的作用可以促进MSCs内源性的TGF-β1的分泌，进一步诱导MSCs向软骨细胞分化[26]。和外加的剪切力和压应力一样，拉伸力也可以作为外界的力学信号实现对MSCs的调控。研究表明不管是对MSCs施加静态的拉伸力还是一定频率的拉伸力都能够促进MSCs成骨分化，同时还是相应的减弱MSCs的软骨、脂肪和神经的分化[27-29]。例如Ward等[28]在胶原基质上培养MSCs时施加了3﹪ ～ 5﹪的拉应力后，显著提高的MSCs成骨基因的表达和矿化的程度。Rui等[29]以0.5 Hz频率的拉应力加载到MSCs的培养基底上，研究结果表明拉应力的加载不仅显著提高了成骨基因和蛋白的表达，而且还促进了BMP-2因子的分泌。

（三）力学信号的调控机制

以上的结果说明了不论是培养基质的弹性模量，还是额外加载的拉应力或者压应力等力学信号均会对干细胞产生调控作用。如今对干细胞是如何感应到相应的力学信号，并在细胞内实现对该信号的传导，然后改变基因的表达和蛋白质的活性成为了研究的热点。大量的研究表明，力学信号的传导首先依靠的是细胞膜上的相关蛋白，主要包括整合素，离子通道以及钙粘素等。其中整合素作为细胞膜上最主要的力学信号传导的蛋白，包含了α和β两种亚型，而且不同的亚型组成所传导的信号也不相同。例如β3被证明与弹性模量诱导MSCs成肌分化相关，而α2与MSCs成骨分化相关。力学信号对离子通道也会产生调控作用，在力学信号的刺激作用下，一些离子通道可以被激活或者停止。而且力学信号的传导不仅会对细胞膜上的离子通道，整合素蛋白等产生影响，还会进一步调控细胞内部的骨架相关的蛋白NMMⅡ和 actin等，将力学信号传导入细胞内，从而调控干细胞的增殖分化等行为[30]。例如在弹性模量的调控作用下，细胞膜上的整合素可以将外界的力学信号通过粘着斑激酶将外界的力学信号转化为在细胞内部传导的化学信号。即外界力学信号的刺激通过引发信号分子的结构发生变化，使其暴露出磷酸化的一端，然后激活相应的酶的级联反应，实现细胞内信号分子的运输，最终达到改变基因表达的效果。

除了上述由细胞膜到细胞内的信号传导模式，外部的力学信号甚至可以直接引起细胞核的变形，从而改变染色体的结构来实现调控信号的转录过程。由于细胞核的表面蛋白与细胞骨架（actin）以及骨架微管（microtubules）等均有连接，因此外界的力学信号可以快速的通过细胞骨架传导到细胞核，而细胞核表面的蛋白又与细胞核内的层粘连蛋白（laminin）等有关联，从而可以进一步影响DNA的复制、转录和表达[31]。Haase等[32]采用原子力显微镜对细胞加载微应力，证明了细胞核在外界微应力的作用下，会快速发生各向异性的变形。并进一步证明了细胞核的变形是受到细胞骨架和骨架微管共同调控的作用。而且细胞核变形后，染色质的合成以及纤连蛋白lamin-A均会受到影响。

三、其他物理信号对干细胞的调控

为了实现对干细胞的定向调控，除了拓扑结构和力学性能外，其它的物理信号如电场，磁场等对干细胞的调控作用也得到了深入的研究。例如，不同形式的电信号刺激可以调控MSCs的分化行为。其中，有研究证明在未加诱导因子的培养条件下，每天施加6 h的10 ～ 40 μA交变电流刺激可以促进MSCs向成骨细胞分化[33]。而有研究采用复合石墨烯的方式制备出具有导电功能的纤维支架，并在该纤维支架的表面培养MSCs，通过电流的刺激实现在体外情况下模拟神经组织的电信号刺激模式。研究结果表明，在此模式下的电信号刺激提高了MSCs神经分化标记物Tuji1和GFAP蛋白和基因的表达，实现调控MSCs向神经细胞分化[34]。类似地，不同的磁场信号也被证明对MSCs具有调控作用。例如，极低频率的磁场被证明具有抑制MSCs成脂分化的作用，而在中等强度的磁场条件下可以促进MSCs的增殖和成骨分化[35-36]。

四、展望

相比于化学信号和生物学信号，物理信号更为稳定可控，安全性更高。近些年来，大量的研究表明物理信号对干细胞或者是多能干细胞的调控发挥着重要的作用，然而物理信号的具体调控机制却仍然不十分明确。因此，今后的研究中应在进一步确认物理信号对干细胞的调控作用，同时对相关调控机制进行深入探索，揭示与物理调控信号直接相关的信号通路和分子机制，推动干细胞治疗的临床应用，以及组织工程与再生医学的发展。

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A review of mesenchymal stem cells behavior regulated by physical cues

Yao Shenglian1,2, Wang Xiumei2, Wang Luning1.1School of Materials Science and Engineering, University of Science and technology Beijing, Beijing 100083, China;2School of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Corresponding author:Wang Xiumei, Email: wxm@mail.tsinghua.edu.cn

Mesenchymal stem cells（MSCs）have become an ideal cells source for the tissue engineering and regenerative medicine, because of their multipotency, easy access, no tumorogenesis risk and no ethical controversy.There are many problems in the process of stem cells therapy and tissue regeneration, such as the uncertain behavior of stem cell migration and differentiation in vivo.In recent years, more attention has been paid in designing biomaterials to regulate stem cells fate.The parameters of biomaterials can be designed to deliver biophysical and biochemical cues and regulate stem cells behavior and physiological function.This review will focus on the function and mechanism of stem cells regulated by various biophysical cues such as topography, mechanical and electric cues.

Mesenchymal stem cells; Signal transduction; Regulation; Review

2016-09-25）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.008

100083 北京科技大学材料科学与工程学院1；100084北京，清华大学材料科学与工程学院2

王秀梅，Email： wxm@mail.tsinghua.edu.cn

姚生莲，王秀梅，王鲁宁.物理信号调控间充质干细胞行为的研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版），2017，7（2）：107-111.