金丝桃苷与DNA结合方式的研究*

乔春玉，张重越，孙艳涛，闫 鹏，肖 雪，朱传勇

（1.黑龙江工程学院 材料与化学工程学院，黑龙江 哈尔滨 150050；2.黑龙江中医药大学 附属第一医院 病理科，黑龙江 哈尔滨 150040；3.吉林师范大学 化学学院，吉林 四平136000）

金丝桃苷与DNA结合方式的研究*

乔春玉1，张重越2，孙艳涛3，闫 鹏1，肖 雪1，朱传勇1

（1.黑龙江工程学院 材料与化学工程学院，黑龙江 哈尔滨 150050；2.黑龙江中医药大学 附属第一医院 病理科，黑龙江 哈尔滨 150040；3.吉林师范大学 化学学院，吉林 四平136000）

研究了黄酮类化合物—金丝桃苷与DNA的相互作用，通过对紫外吸收光谱、熔点温度和黏度的测定，确定了其结合机理。实验结果表明，当金丝桃苷与DNA结合后紫外吸收峰在一定程度上发生了变化。通过熔点曲线和黏度测试进一步验证了金丝桃苷与DNA的结合机理，确定了二者的结合方式是嵌入式结合。

金丝桃苷；DNA；吸收光谱；熔点

前言

脱氧核糖核酸（DNA）是生物体中最基本的遗传物质，同时也是一种非常重要的生物大分子，DNA分子构象和结构的变化在生物体系方面发挥着重要作用。小分子与DNA的作用的研究方法有很多，近年来的相关的报道越来越多[1～3]。DNA与生物的生长，发育以及癌变等异常活动相关。绝大多数药物分子在生物体内的靶向目标都是DNA，通过与DNA的相互作用来控制DNA参与的转录、翻译等过程，从而改变DNA的结构和性质。因此，通过研究药物小分子与DNA的相互作用可以了解药物作用机理，从而进行药物体外筛选，利用药物的构效关系能够进行结构改造，从而设计出活性更高、毒副作用更低的新药。

目前普遍认为：小分子与DNA的非共价键作用包括静电结合、沟区结合和嵌入式结合三种作用方式，前两者也可统称为非嵌入结合方式[4]。

1 实验部分

1.1 试剂

鲑鱼精DNA；金丝桃苷（结构式如图1所示）；BR缓冲溶液；文中涉及到的试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

图1 金丝桃苷的结构式Fig.1 The molecular structure of hyperoside

1.2 仪器

GBC Cintra 10e紫外－可见光谱仪；乌氏黏度计；pHS-3C数字酸度计；电子恒温水浴锅。

1.3 实验方法

分别对金丝桃苷溶液和DNA进行紫外可见吸收光谱测定，再固定金丝桃苷的浓度，向其溶液中加入DNA后，在相同条件下，测定混合液的紫外可见吸收光谱。

分别测定DNA溶液以及DNA－金丝桃苷混合液的最大紫外吸收峰，在20～100℃时，每隔2～5℃记录一次读数，突跃中点的温度即为DNA的熔点（Tm）。

在25℃下，使用乌氏黏度计测定药物对DNA黏度的影响，即固定DNA溶液的浓度，改变金丝桃苷的浓度，分别测定缓冲溶液以及DNA与金丝桃苷混合溶液流经毛细管的时间，平行记录三组数据。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见吸收光谱研究

图2是金丝桃苷（a）、DNA（b）以及DNA-金丝桃苷混合液（c）的紫外可见吸收光谱图。

图2 金丝桃苷（a）、DNA（b）和DNA-金丝桃苷（c）的吸收光谱图Fig.2 The absorption spectra of hyperoside（a）,DNA（b）and DNA-hyperoside（c）

由图2可以看出，加入DNA后，吸收峰在一定程度上发生了变化，但是变化并不是很明显，由此可以说明药物与DNA之间发生了结合反应，但是二者以何种方式结合还不能说明。

2.2 DNA熔点的研究

为了判断金丝桃苷与DNA的结合方式，实验进一步考查了金丝桃苷对DNA熔点的影响。本实验采用研究DNA熔点曲线的经典方法——紫外法。DNA的熔点又称为熔解温度（melting temperature）通常用Tm表示，是DNA加热变性，使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。DNA变性时，物理化学性质将随之发生改变，表现为增色效应（即ε增大的现象）。当DNA达到Tm时，分子内有50%的双链结构被打开，也就是说增色效应达到一半时的温度。

实验中分别对DNA、DNA-金丝桃苷进行了熔点测定，从20～100℃不断记录各温度时体系的吸光度并绘制成曲线，如图3所示。一般情况下，小分子与DNA相互作用能够影响其熔点Tm，若是嵌入式作用则能使DNA的双螺旋结构更加稳定，Tm会增加5～8℃，而非嵌入作用则不会使熔点温度有明显的增加[5]。由图3可以看出，当DNA溶液中加入金丝桃苷后，DNA的熔点明显增加。由此我们可以推断出，金丝桃苷与DNA是以嵌入式结合在一起的。

图3 金丝桃苷加入前（a）后（b）DNA的熔点曲线Fig.3 The melting points curves of DNA in the absence of hyperoside（a）and in the presence of hyperoside（b）

2.3 黏度实验

黏度法即流体力学法是研究药物小分子与DNA作用模式的另一种最有力的实验方法，因为它对DNA的长度变化比较敏感[6]。一般来说，如果药物分子与DNA通过经典嵌插方式作用时，DNA相邻碱基对的距离会变大以容纳插入配体，导致DNA双螺旋链伸长，由此使DNA溶液的黏度增大[7]；当药物分子与DNA以静电、沟槽结合等非嵌插方式与DNA作用时，DNA溶液的黏度无明显变化；以部分插入方式与DNA作用时，则可能使DNA的双螺旋链弯曲或褶皱，长度减小，因而其黏度下降[8]。

在室温下测定了金丝桃苷对DNA黏度的影响。测试液的相对黏度按下式计算：

η＝（t-t0）/t0

其中t0为缓冲液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液（含不同浓度的金丝桃苷）流经毛细管所需的时间，η0为未加金丝桃苷时DNA溶液的相对黏度。根据Cohen和Eisenberg理论[9]，以（η/η0）1/3对结合比率r（r=[金丝桃苷]/[DNA]）作图，可以得到金丝桃苷对DNA溶液黏度的影响，如图4所示。结果表明，随着金丝桃苷浓度的增加，DNA溶液的黏度增大了。这种行为进一步说明，这药物与DNA的结合方式是嵌入式的。

A Study on the Interactions of Hyperoside with DNA

QIAO Chun-yu1,ZHANG Chong-yue2,SUN Yan-tao3,YAN Peng1,XIAO Xue1and ZHU Chuan-yong1
（1.College of Material and Chemical Engineering,Heilongjiang Institute of Technology,Harbin 150050,China;2.Department of Pathology,First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.College of Chemistry,Jilin Normal University,Siping 136000,China）

The interactions of flavonoids with DNA,such as hyperoside with fish sperm DNA were studied.The bonding mechanism was confirmed by the UV-absorption spectrum,melting temperature and viscosity measurement.The experimental results indicated that when bonded to DNA,the absorption peak of hyperoside had changed in a certain extent.The studies on the melting temperature（Tm）curves and viscosity measurements had also verified the bonding mechanism of hyperoside to DNA,and the bonding mode was confirmed to be intercalative bonding.

Hyperoside;DNA;absorption spectrum;melting temperature

R 968

A

1001-0017（2016）06-0439-03

2016-05-12 *基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（编号：12541674）

乔春玉(1980-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，博士，讲师，研究方向：分析化学。E-mail：jingjing_3939@sina.com.