合理应用药物敏感性试验提高耐多药结核病诊断率

吴雪琼 张俊仙



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合理应用药物敏感性试验提高耐多药结核病诊断率

吴雪琼 张俊仙

耐多药结核病(MDR-TB)是目前临床结核病治疗的难题之一，快速检出耐多药的结核分枝杆菌(MTB)，指导临床选择有效抗结核药物，制定合理的化疗方案，是控制MDR-TB的关键。目前抗结核药物的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法主要有下列三类：一是建立在细菌生长基础上的药敏试验方法；二是建立在基因多态性分析基础上的分子药敏试验方法；三是建立在耐药MTB特异组分基础上的色谱、质谱方法。作者概要地介绍了MTB的药敏试验方法，以及联合应用现有药敏检测技术以提高临床对MDR-TB的诊断率。

分枝杆菌，结核； 药物耐受性； 微生物敏感性试验

我国结核病的耐药情况相当严重[1]，耐多药结核病(MDR-TB)是目前临床结核病治疗中亟待解决的难题之一。快速检出耐多药的结核分枝杆菌(MTB)，指导临床选择有效抗结核药物，制定合理的化疗方案，是控制MDR-TB的关键，尤其对复治和难治患者更有意义。由于传统的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法是建立在培养基础上的，繁琐、费时，不能满足临床开展早期、有效治疗的需求。近年来研发建立了一系列快速、有效的药敏试验新方法，部分方法已转化为产品并获得注册证书，可应用于临床。因此，笔者概要地介绍MTB药敏试验的方法，及联合应用现有药敏检测技术，提高临床MDR-TB诊断率。

一、建立在细菌生长基础上的MTB药敏试验方法

细菌的生长特性决定了基于培养基础上的药敏试验方法耗时长，但其可用于分析大多数抗结核药物的耐受性。

1. 传统的药敏试验方法：传统药敏试验是在改良罗氏培养基固体培养的基础上，鉴定MTB对十几种一线和二线抗结核药物的敏感性水平的方法。我国常用绝对浓度法，也有部分实验室采用比例法，该方法简单、经济，适用于基层。由于分枝杆菌生长周期长，该方法通常需1～2个月的时间。

2．分枝杆菌快速培养药敏试验方法：是建立在分枝杆菌快速液体培养(如BACTEC MGIT 960[2]、BacT/ALERT 3D分枝杆菌快速培养系统[3]等)基础上的直接或间接的药敏试验方法，与传统的改良罗氏培养基药敏试验方法具有较好的一致率，报告时间缩短至2～3周，较快速，但进口试剂成本高，只能检测4～5种一线抗结核药物的耐药性，对二线抗结核药物的药敏试验尚停留在实验室阶段[4]。

3．微孔板测定法：是利用比色法或荧光法来检测细菌增殖或活细菌数量的一种药敏试验方法，一般MTB需先培养7～10 d。常用下列氧化还原反应指示剂：MTT [3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑]、刃天青(Alamar-Blue)[5]、MTS [3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑 ]、TTC [2，3，5-三苯基氯化四氮唑]、XTT{3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠}、台盼蓝等，产生肉眼可见的颜色变化，从而判断菌株的耐药性。这些方法简单，不需要复杂的仪器，但杂菌污染易导致假阳性，此外，对实验室生物安全及实验人员的防护要求较高。上述方法大多数尚停留在实验室阶段，而美国赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Scientific)开发出的分枝杆菌药敏检测板Sensititre®MYCOTB，已通过国家食品药品监督管理局注册，可检测MTB对12种一线和二线抗结核药物[包括利福平(rifampicin,RFP)、利福布汀(rifabutin,Rfb)、异烟肼(isoniazid,INH)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、链霉素(streptomycin,Sm)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、阿米卡星(amikacin,Am)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)、乙硫异烟胺(ethionamide,Eto)、卡那霉素(kanamycin,Km)、环丝氨酸(cycloserine,Cs)]的耐药性，各药物与罗氏培养基比例法的一致率达90.0%以上，只需10 d时间即可获得抗结核药物的最低抑菌浓度[6]。

4．噬菌体生物扩增法 (phage amplified biologi-cally assay,PhaB)：分枝杆菌噬菌体对活的MTB具有亲嗜性，MTB受感染后发生裂解，而形成清晰的噬菌斑。由于噬菌体不能感染死的MTB，因此，噬菌斑的数量与宿主菌的活菌数呈正相关。这是利用噬菌体建立的一种间接检测标本中活MTB的快速检测技术，通过检测药物作用后活菌减少的比例，可用来检测MTB对药物的敏感性[7]。英国BIOTEC Lab公司开发的MTB快速诊断试剂盒(噬菌体法；FASTPlaque TBTM)可用于临床检测，只需2 d 时间，无需特殊仪器，成本较低，但需克服因接种MTB量较难准确控制而重复性差、与其他分枝杆菌有交叉感染而特异度不高的问题。

5．硝酸盐还原试验(nitrate reductase assay，NRA)：将MTB接种于含硝酸盐及含药或无药的罗氏培养基中，若MTB生长可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，通过Griess方法检测培养基颜色变化。若含药管无颜色变化为敏感；若含药管呈粉红色或紫蓝色为耐药。可用于直接检测涂阳痰标本中MTB的耐药性，与改良罗氏培养基比例法药敏试验有很好的符合率，但时间缩短至1～2周，而且观察结果直观，不需特殊仪器设备，可用于耐药MTB的初步筛查[8]。

6. 显微镜观察药敏试验(microscopic observation drug-susceptibility assay，MODS)：MTB在细胞培养板中液体培养3～6 d，通过显微镜观察含药孔和不含药孔细菌生长情况，即可简便、快速地检测MTB对各种抗结核药物的敏感性。该方法与传统的绝对浓度法药敏试验结果比较具有很好的符合率(92%～98%)，可用于快速检测耐药MTB，其缺点是需要倒置显微镜观察MTB的生长情况[9]。

7.采用显微镜延时成像的MTB琼脂糖快速药敏试验：MTB接种于微流控芯片的琼脂糖基质中，在液体培养基中的抗结核药物通过琼脂糖扩散到固定在琼脂糖基质中的MTB，通过自动显微镜系统、图像处理程序自动确定MTB对抗结核药物的敏感性，只需9 d时间[10]。

8. 三磷酸腺苷(ATP)生物发光药敏试验：MTB细胞内ATP 水平与细胞存活率呈正相关。抗结核药物杀死MTB后，细胞内ATP 经酶促催化降解后水平降低，试验时加入荧光素-荧光素酶，记录发光值并计算样品ATP含量，即可了解MTB对抗结核药物的敏感性，快速、简便，与罗氏固体培养基法一致率为92.7%[11]。该方法最主要的问题是痰标本中其他细菌的干扰而导致的假阳性。

9. mRNA定量聚合酶链反应(PCR)药敏试验：Ag85B是MTB增殖期分泌的蛋白，当MTB经抗结核药物处理24 h后，应用荧光定量PCR检测其Ag85B mRNA表达水平，若表达水平下降到无药对照管的1%以下为敏感，>10%为耐药，1%～10%之间为可疑。该方法与传统的绝对浓度法具有较好的一致性，也是一种快速有效的耐药检测方法[12]。

10. MPT64药敏检测方法：MPT64是MTB增殖期较丰富的分泌蛋白，耐药菌株在含药培养基中生长MPT64表达水平就高，通过检测含药和不含药培养基中MPT64的含量即可间接反映MTB菌株对药物的敏感程度[13]。目前该方法尚需进一步完善。

11.流式细胞术药敏检测方法：MTB能水解二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)，应用FDA标记经过药物处理后的MTB菌株，然后通过流式细胞术检测带FDA标记的菌株的荧光强度，而间接地检测MTB对药物的敏感性[14]。目前尚处于实验室探索阶段。

二、建立在基因多态性分析基础上的分子药敏试验方法

该方法是采用分子生物学技术检测、鉴定MTB耐药靶基因的突变基因型。近年来随着MTB对一线、二线抗结核药物耐药分子机制的阐明，耐药基因检测试剂盒不断推出。目前，常用的方法有耐药基因测序试剂盒(检测MTB对RFP和INH的耐药基因型)、GeneXpert MTB/RIF(检测MTB对RFP的耐药基因型)、GenoType®MTBDRplus检测试剂盒(检测MTB对RFP和INH的耐药基因型)、GenoType®MTBDRsl检测试剂盒(检测MTB对EMB、氟喹诺酮类、氨基糖苷类药物的耐药基因型)、晶芯®MTB耐药检测基因芯片(检测MTB对RFP和INH的耐药基因型)[15]、INNO-LiPA MTB耐RFP基因型检测试剂盒(INNO-LiPA Rif.TB MTB)及配套的自动检测仪 (Auto-LiPA)及MeltPro®MTB耐药检测系统(实时荧光PCR-探针熔解曲线法；检测MTB对RFP和INH的耐药基因型)[16]等。新的耐药基因检测技术也不断问世，如多层荧光实时定量PCR 方法应用4种荧光标记10个探针分析rpoB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因检测RFP和INH耐药[17]；颜色反应生物芯片药敏试验方法通过不对称多重PCR(templex PCR)、生物芯片杂交和酶颜色反应检测RFP和INH耐药性，与常规的药敏试验方法检测结果具有很高的一致率[18]。应用数字PCR能够较好地检测MTB异质性耐药，可检出1000∶1的敏感株∶耐药株混合物中的突变基因[19]；下一代测序(next-genera-tion sequencing，NGS)将能够更好地检测异质性耐药。分子药敏试验方法最大的优点是快速，只需1～2 d，实现了MDR-TB的快速诊断。但其缺点是可检测的药物有限，仍有许多药物无耐药基因可检测，或检测的敏感度不高。因此，分子药敏试验并不能完全代替传统药敏试验，仍需进一步阐明抗结核药物的耐药分子机制。

三、建立在耐药MTB特异组分基础上的色谱、质谱方法

MTB产生耐药后，其菌株各组分会发生变化，应用色谱技术(薄层层析、气相色谱、液相色谱技术)可分离并解析MTB细胞中各种组分，如脂肪酸、分枝菌酸、单糖等细胞成分，根据指纹图谱或色谱峰的数量、位置和高度，鉴定耐药MTB。应用质谱方法分析MTB耐药菌株与敏感菌株蛋白质表达的差异，根据蛋白指纹图谱也可鉴定耐药MTB[20]。但这些方法都只能分析分离株，而且专用仪器设备和试剂成本高，目前这些方法没有在临床推广应用。

四、联合检测，提高临床MDR-TB的诊断率

目前，临床上采用任何单一的药敏试验方法均无法完全满足临床需求，需采用多种方法联合检测以提高耐药结核病的检出率[21]。将可检测对一、二线抗结核药物的基于细菌生长的快速药敏试验方法与在1～2 d内即可检出对部分药物耐药的MTB耐药基因型的分子诊断方法相结合，优势互补，可快速、敏感地诊断MDR-TB。

目前，国内大多实验室采用分枝杆菌快速培养系统和改良罗氏培养基相结合进行药敏试验，首先通过分枝杆菌快速培养系统提高MTB培养的阳性率，缩短培养时间；而后通过改良罗氏培养基进行药敏试验，增加进行药敏试验药物的种类，尤其是二线抗结核药物的快速药敏试验对于确定MDR-TB治疗方案是非常需要的，同时也降低了污染率和检测成本，但仍需1个月左右的时间。

目前，国内实验室大多是采用分子药敏试验方法检测涂阳或培阳的临床标本，阳性检出率较高，但传统细菌学方法的低检出率也导致一些菌阴耐药结核病患者未能得到早期诊断。

笔者所在实验室将荧光定量PCR检测MTB和NTM方法与耐药基因检测技术联合应用，通过耐药基因芯片直接检测荧光定量PCR检测MTB DNA阳性的临床标本，以确定MTB对RFP和INH的耐受性，31%涂阴和17%培阴的临床标本通过基因扩增可进行耐药基因分析，提高了耐药结核病患者的阳性检出率，检测耐多药的MTB与传统罗氏培养药敏试验的一致率达83%～87%，敏感度70%～80%，特异度83%～90%[15]，并且只需1～2 d时间，实现了真正意义上的快速药敏，对于MDR-TB的早期诊断、有效治疗具有重要的现实意义。但该方法检测其他一、二线抗结核药物的敏感度和特异度还有待进一步提高，部分二线药物的耐药分子机制还需阐明。

新的表型药敏试验与分子药敏试验联合应用将提高耐药MTB的检出率，如硝酸盐还原试验与反向斑点杂交试验联合检测MTB耐药性，其结果与传统的绝对浓度法药敏试验具有高度的一致性，敏感度和特异度均优于单一方法[22]。

综上所述，MTB药敏试验方法很多，但已获得国家食品药品监督管理局医疗器械注册证书者不多，而在临床广泛推广应用的新技术更少。因此，表型药敏试验仍是临床判断耐药性、确定治疗方案的主要依据，而分子药敏试验为MDR-TB的早期诊断提供了有效的手段，若两者联合应用将在MDR-TB的控制方面发挥重要作用。

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(本文编辑：薛爱华)

Rational use of drug sensitivity test techniques to improve the diagnosis rate of multidrug-resistant tuberculosis

WUXue-qiong,ZHANGJun-xian.

InstituteforTuberculosisResearch,ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,the309thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100091,China

Correspondingauthor:WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

At present, multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is one of the difficult problems in clinical treatment of tuberculosis. The rapid detection of drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(MTB), to guide the clini-cal selection of effective anti-TB drugs, to determine reasonable chemotherapy regimen, were the key points to control MDR-TB. There are mainly three kinds of anti-TB drug sensitivity test methods as follow: (1) the anti-TB drug sensitivity test methods based on bacterial growth; (2) the molecular drug sensitivity test methods based on the gene polymorphism analyses; (3) the chromatography and mass spectrometry methods based on specific components of drug-resistant MTB. This paper briefly introduces the MTB drug sensitivity test methods, and the combined use of the existing drug sensitivity testing techniques, to improve the clinical diagnosis rate of MDR-TB.

Mycobacteriumtuberculosis; Drug tolerance; Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.003

100091 北京，解放军第三〇九医院全军结核病研究所 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室

吴雪琼，Email: xueqiongwu@139.com

2016-10-27)