健脾补土法组方对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织t-PA、PAI-1、ColⅣ的影响*

钟银玲李 花，3△刘旺华彭智远，2

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙，410208；2.湖南中医药大学中医诊断学重点学科，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学数字中医药协同创新中心，湖南 长沙 410208）

·研究报告·

健脾补土法组方对脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织t-PA、PAI-1、ColⅣ的影响*

钟银玲1李 花1，3△刘旺华2，3，4彭智远1，2

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙，410208；2.湖南中医药大学中医诊断学重点学科，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学数字中医药协同创新中心，湖南 长沙 410208）

目的观察健脾补土法组方对脑缺血/再灌注损伤大鼠t-PA、PAI-1、ColⅣ的影响，探讨其保护神经细胞可能作用机制。方法 将72只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、健脾补土方小剂量组、健脾补土方中剂量组、健脾补土方大剂量组，每组12只。采用线栓法制备MCAO模型，治疗7 d后处死，并在大鼠处死前进行神经功能缺损评分，应用酶联免疫吸附（ELISA）法测定中组织型纤溶酶原激活物（t-PA）及组织型纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的变化，运用免疫组化法测定胶原蛋白Ⅳ（ColⅣ）的含量变化。结果与模型组相比，健脾补土小、中、大剂量组神经功能缺损症状评分减少（P<0.05）；健脾补土方小、中、大剂量组t-PA表达明显降低（P<0.05或P<0.01）；健脾补土方小、中、大剂量组PAI-1表达明显升高（P<0.05或P<0.01）；健脾补土方小、中剂量组Col IV表达明显升高（P<0.05）。结论健脾补土法组方能改善脑缺血/再灌注损伤大鼠神经缺损，可能与其下调t-PA及上调PAI-1的表达，从而减少细胞外基质（ECM）的降解，上调ColⅣ的表达有关。

脑缺血/再灌注 健脾补土法 组织型纤溶酶原激活物 组织型纤溶酶原激活物抑制物-1 胶原蛋白Ⅳ

脑卒中是一类临床常见病，具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率的“四高”特点［1］。脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发生率达85%，其中，进展性脑卒中占20%~40%［2］，常致患者遗留严重的功能残疾。缺血性脑卒中易发生再灌注损伤。凝血系统和纤溶系统的平衡失调在脑梗死发病机理中所起到的作用日益受到关注。t-PA、PAI是反应体内纤溶活性的重要指标，纤溶状态取决于t-PA和PAI的平衡情况。ColⅣ是细胞外基质的重要成分之一，具有支撑、保护细胞外基质的作用。而健脾补土法组方对脑缺血疾病有保护作用，在临床上也应用于脑卒中的恢复期治疗［3］。本研究采用改良Longa EZ等［4］线栓法建立大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型（MCAO模型），探讨健脾补土法组方对t-PA、PAI-1、ColⅣ含量的影响及神经功能缺损评分的影响，从而探讨健脾补土法组方改善脑缺血/再灌注损伤大鼠神经缺损与细胞外基质、纤溶系统关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组 雄性SPF级SD大鼠72只，体质量230~270 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCSK（湘）2013-0004。动物合格证号：NO43004700006140。SPF级实验室喂养，室温20~25℃，相对湿度35%~65%。将72只SD雄性大鼠在造模前进行初分组，按随机数表法分为假手术组12只、模型制备组60只。将造模后的60只大鼠随机分成模型组、依达拉奉组、健脾补土方小剂量组、健脾补土方中剂量组、健脾补土方大剂量组5组。每组12只。

1.2 药物 健脾补土法组方药物组成：人参15 g，白术12 g，茯苓10 g，黄芪15 g，山药12 g，薏苡仁12 g，炙甘草6 g（各药物从湖南中医药大学附属第一医院购买）。取各药加水适量，浸泡2 h，水煎煮。第1次用6倍水，煎煮40~50 min；第2次用3倍水，煎煮30 min。2次水煎液混合，浓缩至生药浓度为1 g/mL，灭菌分装，4℃冷藏备用。依达拉奉注射液，吉林省博大制药有限公司生产，批号80-140603，国药准字H20070051，规格10 mL/15 mg。

1.3 试剂与仪器 MK3酶标仪，美国BIO-TEK；ColⅣ免疫组化试剂盒，批号MK0749，武汉博士德生物工程有限公司提供。大鼠纤溶酶原激活物（t-PA）ELISA试剂盒，批号QY-R2058，武汉博士德生物工程有限公司提供。大鼠纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）ELISA试剂盒，批号SBJ-R0005，武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.4 模型制备 采用改良Longa EZ等的线栓法建立大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型 （MCAO模型），于缺血2 h后进行再灌注。假手术组除不插线外，其余过程同造模组。模型成功者纳为研究对象，意外死亡大鼠由预备大鼠随时补给。

1.5 给药剂量与方式 给药剂量根据70 kg成人每日服用82g生药剂量按体表面积进行换算，从手术后清醒后开始给药，每日同一时间点给药，连续给药7 d。具体如下：假手术组（灌胃蒸馏水；腹腔注射0.9%氯化钠注射液）、模型组（灌胃蒸馏水；腹腔注射0.9%氯化钠注射液）、依达拉奉组（3.2 mg/kg，腹腔注射；灌胃蒸馏水）、健脾补土小剂量组（灌胃剂量3.69 g/kg，相当于1/2临床等效剂量；腹腔注射0.9%氯化钠注射液）、健脾补土中剂量组（灌胃剂量7.38 g/kg，相当于临床等效剂量；腹腔注射0.9%氯化钠注射液）、健脾补土大剂量组（灌胃剂量14.76g/kg，相当于临床等效剂量2倍；腹腔注射0.9%氯化钠注射液）。

1.6 标本采集与检测 1）给药7 d后取材，从各组中随机抽取6只大鼠，将大鼠经10%水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑放于冰盘上，小心剥离软脑膜，取缺血区大脑皮层组织，将取的大脑皮层组织用冰PBS洗涤后放入消毒后EP管并标记。80℃保存备用。采用ELISA法检测t-PA和PAI-1。向预存脑组织中加入PBS冰浴充分匀浆，3500 r/min离心15 min后取上清液，先向待测样品孔中加入待测样品，洗涤后加一抗工作液，充分反应；洗涤后加酶标抗体工作液，充分反应；洗涤后加入底物工作液，充分反应后加入终止液，酶标仪450 nm波长下读取吸光度值（OD值），以标准品之OD值绘制标准曲线，根据标准曲线公式换算含量。2）将每组余下的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后，固定后打开胸腔暴露心脏，经左心室快速灌注生理盐水200 mL，至流出液变清，再缓慢灌注4%多聚甲醛300 mL，至肝脏变硬白后断头取脑，切取左侧视交叉后5 mm的冠状切片，层厚为5 μm，置于4%多聚甲醛固定24 h以上。制成石蜡切片。采用免疫组化法检测ColⅣ。将切片脱蜡至水，3%H2O2去离子水孵育10 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加ColⅣ抗体，37℃孵育2 h，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加聚合物辅助剂，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加辣根酶标记，抗兔IgG多聚体，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，DAB显色液室温下显色，冲洗，复染、脱水、透明、封片。用PBS代替ColⅣ抗体作阴性对照。在大鼠脑缺血皮质区同倍（400倍）的6个不同视野，用病理图像分析软件系统分析。统计每个视野下ColⅣ平均灰度值，取平均值。

1.7 神经功能评分 根据国际公认的大鼠脑卒中后神经功能缺损评分法即mNSS评分［5］进行神经功能评分，采用双盲法，缺血再灌注后第7日处死前2 h进行评分。评判标准：1~6分为轻型受损；7~12为中型受损；13~18分为重型受损。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件分析。计量资料以（s）表示。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnet’s T3法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组神经功能缺损评分比较 见表1。各造模组动物在造模清醒后均出现了神经功能缺损症状，假手术组在造模清醒后及处死前都没出现神经功能缺损症状。与假手术组相比，模型组的神经功能缺损症状评分显著增加（P<0.01）；与模型组比较，依达拉奉组、健脾补土小剂量、健脾补土中剂量组、健脾补土大剂量组神经功能缺损症状评分显著降低（P<0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分及脑组织ColⅣ表达水平比较（s）

表1 各组大鼠神经功能评分及脑组织ColⅣ表达水平比较（s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n ColⅣ（ng/L） 神经功能评分（分）假手术组 6 121.55±46.92 0.00±0.00模型组 6 51.34±13.15*9.17±2.14*依达拉奉组 6 87.42±20.73△4.83±1.17△△健脾补土小剂量组 6 90.29±35.71△6.67±1.37△△健脾补土中剂量组 6 89.16±14.76△5.17±2.14△△健脾补土大剂量组 6 78.18±18.41 5.00±2.00△△

2.2 健脾补土法组方对ColⅣ表达的影响 见表1。与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织中ColⅣ表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，依达拉奉组及健脾补土方小、中剂量组ColⅣ表达明显升高（P<0.05）。2.3 各组t-PA、PAI-1水平比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织中t-PA、PAI-1表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，依达拉奉组及健脾补土方中、大剂量组t-PA表达明显降低（P<0.05或P<0.01），依达拉奉组及健脾补土方小、中、大剂量组PAI-1表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。

3 讨 论

中医学认为脑结构和功能的物质基础为“血气”与“精气”，脑的正常活动需气血津液的滋养［6］。脾胃为后天之本，气血津液生化之源。故有“内伤脾胃，百病由生”之说。本研究健脾补土组方是在中医辨证论治和整体观念指导下由多味中药配伍而成［7］，其中四君子汤为治疗脾胃气虚的基本方［8］，方中人参甘温益气；白术健脾燥湿；茯苓健脾渗湿；炙甘草益气和中，调和诸药；山药能补脾益气，补肾滋阴；黄芪能保护脾胃升发之气，且能避免苦寒之品伤脾败胃；脾虚则生湿，故加薏苡仁利水健脾渗湿。诸药配伍地当，健脾补土之功尤著。

表2 各组大鼠脑组织t-PA、PAI-1表达水平比较（s）

表2 各组大鼠脑组织t-PA、PAI-1表达水平比较（s）

组 别 n t-PA（ng/L） PAI（ng/L）假手术组 6 242.96±72.44 101.31±22.91模型组 6 543.29±112.67**189.86±24.94**依达拉奉组 6 406.62±148.01△319.48±27.66△△健脾补土小剂量组 6 339.13±122.11△△284.94±41.43△健脾补土中剂量组 6 383.00±89.73△299.49±50.33△健脾补土大剂量组 6 342.51±93.53△△338.90±70.93△

神经细胞外基质的破坏和降解在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用［9］。ECM是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，不仅在支持、连接和维持组织形态方面起重要作用，而且具有调节细胞粘附、生长、分化、促进细胞迁移、增殖、离子交换和信息传递的功能。胶原（Col）是细胞外基质的重要成分之一，可与细胞表面上的特异性受体结合，通过受体与细胞骨架结构直接联系或通过细胞内的一系列信号传导而引起不同的下游基因的表达［10］。本课题前期研究［3，7，9，11］结果显示，经健脾补土方药治疗后，脑卒中患者MMSE、ADL、HDS量表得分均有明显升高，表明健脾补土方药对改善缺血性脑卒中患者后遗症有较好疗效；健脾补土法对脑缺血/再灌注（I/R）损伤后大鼠神经功能评分有改善，能降低神经元凋亡指数，保护血脑屏障，抑制NF-κB炎症信号通路，增加某些ECM成分如LN表达和减少基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达。

人体的纤溶系统主要由纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活剂抑制剂组成［12］。t-PA及PAI是反应体内纤溶活性的重要指标，纤溶状态取决于t-PA和PAI的平衡情况，PAI与t-PA形成1∶1复合物，使t-PA失活［13］。t-PA是纤溶系统的主要激活剂，它通过激活纤溶酶原形成纤溶酶而溶解纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物。近年来国内有关t-PA与细胞外基质关系的研究不多。有研究表明［14］，t-PA可能通过产生纤溶酶原以及激活基质金属蛋白酶而在细胞外基质降解过程中起重要作用。也有研究显示［15］，脑梗死患者血浆t-PA及PAI-1活性均高于正常组，且t-PA增高幅度较PAI-1大，体内纤溶系统相对亢进。有动物实验［16］表明，MCAO大鼠在脑缺血再灌注损伤后，神经元及血管内皮细胞t-PA表达增加。

本实验结果显示，在脑缺血在灌注后，模型组t-PA及PAI活性均高于正常组，且t-PA增高幅度较PAI大，而检测的模型组大鼠缺血侧脑组织中ColⅣ表达明显降低，可以推测在脑缺血再灌注后纤溶活性增强，作为纤溶系统主要激活剂的t-PA很有可能激活金属基质蛋白酶而参与细胞外基质比如ColⅣ降解过程。这种推测与本课题前期研究结果相符合。在连续给药7 d后，依达拉奉组、健脾补土小剂量、健脾补土中剂量组、健脾补土大剂量组神经功能缺损症状评分减少，能不同程度降低t-PA的表达，抑制了纤溶系统活性，且升高ColⅣ表达，减少细胞外基质的降解，保护神经细胞。其保护神经细胞的作用的具体机制仍有待研究，可能与药物剂量及治疗的时间长短等有关。

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The Effect of Spleen-strengthening Therapy on t-PA and PAI and Col IV in Rats with Cerebral Ischemi-a/Reperfusion Injury

Z HONG Yinling，LI Hua，LIU Wanghua，et al. School of Traditional Chinese Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To study the effect of Spleen-strengthening therapy on t-PA，PAI-1 and ColⅣand in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury and investigate its possible mechanism.Methods：72 male SD rats were randomly divided into sham-operation group，modelling group，edaravone group and low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group，high-dosed spleen-strengthening group，12 in each group.The models of MCAO were induced by middle cerebral artery occlusion and recanalization executed after treatment of 7 days，and nerve function defect score of the rats was evaluated before death.ELISA was used to detect the expression levels of t-PA and PAI-1.Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of ColⅣ.Results：Compared with the modelling group，nerve function defect score was obviously decreased（P<0.05）in low-dosed spleen-strengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and highdosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of t-PA was obviously decreased（P<0.05 or P<0.01）and PAI was obviously increased（P<0.05 or P<0.01）in low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and high-dosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of ColⅣwas obviously increased（P<0.05）in low-dosed spleenstrengthening group and middle-dosed spleen-strengthening group.Conclusion：Spleen-strengthening therapy decreases neurological deficit in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be the inhibi-tion of the expression of t-PA and promotion of the expression of PAI，which promotes the expression of ColⅣand reduces the degradation of ECM.

Cerebral ischemia/reperfusion；Spleen-strengthening therapy；t-PA；PAI-1；ColⅣ

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2213-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.002

2016-09-19）

国家自然科学基金项目（81202632、81473567）；教育部博士点基金项目（20124323120003）；湖南省自然科学基金项目（13JJ3097）；湖南省教育厅优秀青年基金项目（14B134）；湖南省教育厅高校创新平台基金项目（15K092）

△通信作者（电子邮箱：flora119@sina.com）