MAS育种改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性

刘金灵陈海龙杨丰宇黄俊廖花

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，长沙410128；3作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；4南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙410128）

MAS育种改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性

邹俊锋1，李永聪1，刘雄伦1，2，3，4*，刘金灵1，2，3，4，陈海龙1，杨丰宇1，黄俊1，廖花1

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，长沙410128；3作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；4南方粮油作物协同创新中心，湖南长沙410128）

利用已克隆的广谱抗稻瘟病基因Pi9的DNA序列，设计功能分子标记Ins2-3，通过标记基因型辅助选择和连续回交育种实践，定向改良籼稻恢复系E32及其两系杂交种培矮64S/E32的稻瘟病抗性。获得以下结果：Ins2-3是一个高效共显性DNA标记，在Pi9供体亲本75-1-127和受体亲本E32基因组中分别扩增出一条793 bp和2 kb的稳定条带，Ins2-3的辅助选择效率达100%；利用Ins2-3开展分子标记辅助选择育种，通过连续多代回交自交，育成了苗瘟和穗瘟抗性均显著提高的新恢复系E32-Pi9，其遗传背景与受体亲本E32一致；用E32 -Pi9配制的两系杂交种培矮64S/E32-Pi9的稻瘟病抗性，比对照培矮64S/E32显著提高，而主要农艺性状及杂种优势表现非常相似。

水稻；稻瘟病抗性改良；Pi9基因；分子标记辅助选择

水稻是重要的粮食作物，全球一半以上人口以稻米为主食［1］。然而，作为水稻主要病害的稻瘟病（rice blast），可在水稻不同生育时期造成危害，流行年份可使水稻减产10%～30%，严重时甚至造成绝收［2］。由于多数杂交稻亲本的稻瘟病抗性不强，很大程度上限制了一些强优势组合的推广应用。长期实践表明，发掘、鉴定和利用广谱持久抗性基因，选育和推广抗病品种（组合）是控制稻瘟病害最经济、有效和安全的策略［3］。分子标记辅助选择（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）育种可定向改良个别性状而不改变受体遗传背景，且没有转基因生物安全性风险，是现代分子育种的重要手段。来源于小粒野生稻的Pi9基因位于水稻第6号染色体的Pi2/9位点，与Pi2、Piz-t、Pigm、Pi50、Pi2-2等抗瘟基因互为复等位基因，是一个已被成功克隆的广谱持久抗性基因［4～9］。本研究利用Pi9基因序列设计并筛选高效DNA标记，并应用分子标记辅助选择育种技术开展连续回交育种，定向改良籼稻恢复系‘E32’及其杂交种的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Pi9基因供体亲本‘75-1-127’，受体亲本‘E32’；两系杂交种‘培矮64S/E32’，改良杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’；稻瘟病室内接种抗病对照‘75-1-127’，感病对照品种‘CO39’；本实验室收集的来自国内外不同稻区的稻瘟菌小种或菌株25份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 Pi9基因功能分子标记的开发

Pi9基因含有2个内元，长度分别为5362 bp和128 bp；cDNA全长4009 bp，包括3099 bp的编码区和910-bp 3′UTR［5］。利用Pi9基因序列信息设计分子标记，用候选标记分别PCR扩增75-1-127和E32基因组，做多态性分析，筛选出稳定高效的多态标记用于MAS育种。

1.2.2 供试水稻材料稻瘟病抗性鉴定及抗谱分析

室内接种水稻材料包括Pi9供体亲本‘75-1-127’、受体亲本‘E32’、改良品系‘E32-Pi9’、感病对照‘CO39’。供试水稻材料播种于塑料盆中，加入花卉营养土于人工气候室中育苗（26～28℃，正常光照）。4叶期采用单菌株约1×105个/mL浓度的稻瘟菌孢子悬浮液室内喷雾活体接种，26℃黑暗保湿24 h，然后在26～28℃、高湿、正常光照条件下诱导发病5～7 d。参照Bonman的0～5级标准调查病情并分类［10］（0～2级为抗病类型，3～5级为感病类型），统计抗性频率。另外，所有水稻材料2016年5月14日播种于浏阳大围山病圃，6月中旬调查苗瘟，9月中旬调查穗瘟，鉴定田间抗性。

1.2.3 标记基因型分析

CTAB法提取水稻叶片总DNA［11］。用获选多态分子标记对各DNA样品做PCR扩增。PCR反应体系（10μL）：DNA模板（约100 ng/μL）1.0μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0μL，10×Buffer 1.0μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL，5 U/μL r-Taq酶（大连宝生物）0.1μL，ddH2O 6.7μL；PCR反应程序：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，分析带型（标记基因型）。

1.2.4 MAS育种实践

2010～2015年在长沙（夏季）和三亚（冬季），用‘E32’作受体亲本及轮回亲本、‘75-1-127’作Pi9基因供体亲本，杂交及连续回交自交，开展MAS育种实践。2015年获得BC6F3群体，在此基础上鉴定出含Pi9基因的抗病纯系‘E32-Pi9’，同年用两用不育系‘培矮64S’配制杂交种。

2 结果与分析

2.1 供试亲本水稻的稻瘟病抗性及抗菌谱

室内接种结果表明，Pi9基因供体‘75-1-127’的抗性强抗谱广，除了对来自日本的小种KOH和来自韩国的小种ROR1表现感病外，对其余来自国内外不同稻区的23个小种（菌株）均表现高水平抗性，抗性频率为92.0%；受体亲本‘E32’对11份小种（菌株）表现抗病，对其余14份小种（菌株）感病，抗性频率为44.0%，表明‘E32’的稻瘟病抗性水平低、需要改良；感病对照品种‘CO39’对所有25份供试小种（菌株）均表现感病，抗性频率为0（表1）。

表1 供试水稻亲本的稻瘟病抗菌谱比较Table1 Resistancespectrumofthetestedriceparents to25M.oryzaeisolates

2.2 高效多态分子标记的获得

经过反复设计与筛选，获得了1个高效的DNA标记Ins2-3，该标记位于Pi9基因第一个内元，为共显性分子标记。Ins2-3在Pi9基因供体‘75-1 -127’中扩增出793 bp的单一稳定条带，在受体亲本‘E32’中扩增出一条约2 kb的单一稳定条带（图1）。用Ins2-3在各回交世代开展的MAS育种实践中，其辅助选择效率可达100%（数据未发表），表明Ins2-3是一个高效可靠实用的分子标记。

2.3 水稻抗病新品系E32-Pi9的鉴定

为了获得含有Pi9基因的抗病纯系，用E32/75 -1-127的BC6F3株系为材料，通过Ins2-3的单株基因型分析和室内接种抗性表型鉴定，筛选出1个抗病纯系‘E32-Pi9’（图1）。‘E32-Pi9’不仅Pi9基因位点纯合，而且主要农艺性状和产量性状也已经稳定，与受体亲本‘E32’的遗传背景基本一致（数据未发表）。

图1 抗稻瘟病水稻纯系‘E32-Pi9’的鉴定Fig.1 Identificationofricepureline‘E32-Pi9’withhigh-levelblastresistance

2.4 ‘E32-Pi9’及其杂交种的稻瘟病田间抗性

为进一步检验抗病纯系‘E32-Pi9’及其杂交种的稻瘟病田间抗性，2016年对相应材料进行了病圃自然抗性鉴定。结果表明，‘E32-Pi9’及其杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’均表现出高水平的苗瘟和穗瘟抗性（苗瘟0级，穗瘟1级），与供体亲本‘75-1-127’的抗性水平相当；而相应的受体亲本‘E32’及其杂交种‘培矮64S/E32’的田间抗性水平低（苗瘟4级、穗瘟5级）（图2）。说明用显性广谱抗瘟基因Pi9改良水稻稻瘟病抗性是行之有效的。另外，抗病杂交种‘培矮64S/E32-Pi9’的主要农艺性状及杂种优势表现，与对照‘培矮64S/E32’相当（数据未发表）。

图2 改良抗病品系‘E32-Pi9’及其杂交种的田间抗性表现Fig.2 Fieldblastresistanceperformanceofimprovedriceline‘E32-Pi9’anditshybrid

3 讨论

稻瘟病是水稻的主要病害，抗性育种是解决稻瘟病危害最有效的策略。实践证明，Pi9基因（位点）具有广谱持久抗性，且为显性遗传，在杂交水稻稻瘟病抗性育种中具有广阔的应用前景。水稻稻瘟病抗性是一个典型的质量—数量性状，抗病性表型既由基因控制又受环境影响，因此传统育种方法很难准确选择。而MAS育种不但准确、高效、安全，而且可以在早期选择，在抗病性育种中显示出独特优势。另外，高水平的稻瘟病抗性往往是多个基因共同作用的结果，而MAS育种转移的通常是整个基因位点（基因家族），效果比通过转基因法导入单个基因更好，我们的育种实践结果很好地证明了这一现象。

由于稻瘟病菌生理小种（菌株）的多样性及易变性，往往导致抗病水稻品种在不同稻区或年份间抗性不一致、不稳定，一定程度上限制了抗性基因和抗性品种的推广应用［12］。实践证明，将多个抗菌谱不同的抗瘟基因聚合到同一个水稻品种中，是培育广谱持久抗瘟新品种的良策［13，14］。本实验室同时在研究和利用另一个广谱抗瘟基因Pigm。Pigm与Pi9具有交叉抗菌谱，我们已经开展包括Pi9、Pigm在内的多个广谱抗瘟基因的聚合育种，旨在培育出抗谱更广、抗性更强更持久的水稻新品种（组合）［15～19］。

［1］ 杨勤忠，林菲，马淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展［J］.中国农业科学，2009，42（5）：1601-1615.

［2］ 孙国昌，杜新法，陶荣祥，等.水稻稻瘟病防治研究进展和21世纪初研究设想［J］.植物保护，2000，26（1）：33-35.

［3］ 吴 俊，刘雄伦，戴良英，等.水稻广谱抗稻瘟病基因研究进展［J］.生命科学，2007，19（2）：233-238.

［4］ Liu G，Lu G，Zeng L，et al.Two broad-spectrum blast resistance genes，Pi9（t）and Pi2（t），are physically linked on rice chromosome 6［J］.Molecular Genetics and Genomics，2002，267（4）：472-480.

［5］ Qu S，Liu G，Zhou B，etal.The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding siteleucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice［J］.Genetics，2006，172：1901-1914.

［6］ Zhou B，Qu SH，Liu GF，et al.The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to magnaporthe grisea［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2006，19（11）：1216-1228.

［7］ Deng YW，Zhu XD，Shen Y，et a1.Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm（t）tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety［J］.Theoretical and Applied Genetics，2006，113（4）：705-713.

［8］ Zhu XY，Chen S，Yang JY，et al.The identification of Pi50（t），a new member of the rice blast resistance Pi2/ Pi9 multigene fam ily［J］.Theoretical and Applied Genetics，2012，124（7）：1295-1304.

［9］ Jiang N，Li ZQ，Wu J，et al.Molecular mapping of thePi2/9 allelic gene Pi2-2 conferning broad-spectrum resistance to Magnaporthe oryzae in the rice cultivar Jefferson［J］.Rice，2012，5：29.

［10］Bonman JM，VergelD，Dios TI，etal.Physiologic specialization of Pyricularia oryzae in the Philippines［J］.Plant Dis，1986，70：767-769.

［11］Murray MG，Thompson WF.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］.Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4326.

［12］戴小军，杨远柱，周 亮，等.抗稻瘟病水稻资源抗性基因Pita、Pib、Pi9以及Pikm的分布研究［J］.生命科学研究，2012，16（4）：340-344.

［13］安正帅，刘国兰，梅捍卫，等.标记辅助改良节水抗旱杂交稻亲本材料的稻瘟病抗性［J］.分子植物育种，2010，8（6）：1172-1176.

［14］王 军，杨 杰，陈志德，等.利用分子标记辅助选择聚合水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b、Stv-bi［J］.作物学报，2011，37（6）：975-981.

［15］文 婷，梁 毅，江 南，等.利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性［J］.湖南农业大学学报，2012，38（3）：262-266.

［16］梁 毅，杨婷婷，谭令辞，等.水稻广谱抗瘟基因Pigm紧密连锁分子标记开发及其育种应用［J］.杂交水稻，2013，28（4）：63-68.

［17］杨婷婷，刘雄伦，谭令辞，等.水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用［J］.作物研究，2014，28（3）：231-235

［18］谭令辞，刘雄伦，杨婷婷，等.利用Pi9基因分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品系［J］.作物研究，2015，29（4）：348-351，356

［19］行 璇，刘雄伦，陈海龙，等.分子标记辅助选择Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性［J］.作物研究，2016，30（5）：487-491.

Improving Blast Resistance of Rice Restorer‘E32’and Its Hybrid through Molecular Marker-assisted Selection

ZOUJunfeng1，LIYongcong1，LIUXionglun1，2，3，4*，LIUJinling1，2，3，4，CHENHailong1，YANGFengyu1，HUANGJun1，LIAOHua1

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Key Laboratory of Hunan Province for Disease Resistance Breeding of Rice and Rapeseed，Changsha，Hunan 410128，China；3 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；4 Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops，Changsha，Hunan 410128，China）

To improve blast resistance of the indica rice restorer E32 and its hybrid，amolecularmarker，Ins2-3，was developed based on the DNA sequence of the cloned broad-spectrum blast resistance gene Pi9，and marker-assisted selection breeding practicewas implemented in thisstudy.Themain resultswere as follows：Ins2-3 was a co-dominantmarker，showing stable polymorphism between the Pi9 donor 75-1-127 and the receptor E32 by producing a793bp and a 2kb PCR band respectively，and the phenotype selection efficiency bymarkergenotype reached 100%.A new restorer line E32 -Pi9 and its hybrid Peiai64s/E32-Pi9，with high-level seedling and spike blast resistance and unchanged genetic background，were bred.

rice；blast resistance improvement；the Pi9 gene；molecularmarker-assisted selection

S511.034

A

1001-5280（2017）01-0011-04

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2017.01.03

2016 11 28

邹俊锋（1987-），男，硕士研究生，Email：zoujunfeng185@163.com；并列第一作者：李永聪（1986-），男，硕士研究生，Email：465655693@qq.com。*通信作者：刘雄伦，教授，Email：xionglun@hunau.edu.cn。

国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08001-002）；湖南省科技重大专项（2015NK1001）。