退变性脊柱侧凸病因学的基础研究进展

刘永胜 赵宇

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京100730）

∙综述∙

退变性脊柱侧凸病因学的基础研究进展

刘永胜 赵宇*

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京100730）

退变性脊柱侧凸严重影响中老年人的生活质量，但是其确切病因仍不清楚。近年来，随着多种分子生物学技术的发展，国内外学者在探索退变性脊柱侧凸病因学的基础研究上取得了较大的进步，为进一步明确其发病机制和治疗靶点奠定了基础。本文就退变性脊柱侧凸目前病因学的基础研究进行综述，希望为下一步研究提供资料。

退变性脊柱侧凸；病因；基因；microRNA；蛋白

退变性脊柱侧凸（degenerative scoliosis,DS）是指既往无脊柱侧凸病史，骨骼发育成熟的患者在各种退行性变化的基础上逐渐出现的冠状位上Cobb角大于10°的脊柱畸形。DS是成人脊柱侧凸的一种类型，而青少年特发性脊柱侧凸进展到成人期则不能归属于退变性脊柱侧凸的范畴。退变性脊柱侧凸逐渐加重常引起下腰痛，下肢放射性疼痛等症状，累及脊髓神经结构则会出现严重的神经功能障碍，严重影响中老年人的生活质量。文献报道退变性脊柱侧凸的发生率为1%～30%[1]，而中国汉族人群的发病率约为13.3%[2]。目前，退变性脊柱侧凸的发病机制尚未得到充分阐释，椎间盘的非对称性退变被认为是DS发生的直接因素[3]。椎间盘退行性改变的遗传性因素已被广泛研究[4-6]，而DS的发生是否存在基因、蛋白等相关的遗传因素尚不明确。现将退变性脊柱侧凸病因学的基础研究进展综述如下。

1 基因组学研究

拷贝数变异（copy number variations,CNVs）是由于基因组发生重排导致的，一般指长度大于1Kb的基因。为了鉴定退变性腰椎侧凸（degenerative lumbar scoliosis,DLS）患者中是否存在基因CNVs以及遗传倾向的可能，Shin等[7]对15例显著侧凸的DLS患者和58例正常对照的血液样本进行了比较基因杂交技术（comparative genomic hybridization,CGH）微阵列分析，然后通过PCR技术进行基因扩增，分析得到3种与DLS相关的CNVs：TMEM163，ANKRD11，NFATC1。研究表明[8]，ANKRD11的错义突变可影响骨量的变化，小鼠的异质杂合突变可导致颅面部骨骼畸形，而这些也说明ANKRD11可通过影响神经外胚层的发育影响脊柱侧凸的形成。有报道发现NFATC1基因与腰椎骨密度相关，因而该基因可能通过影响腰椎骨密度进而影响侧凸的发生[9]。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。退变性脊柱侧凸是否存在SNPs的变化引起了越来越多的学者的关注。研究发现谷氨酸可通过骨细胞膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）调控骨骼重塑[10]。韩国学者Kim等[11]从基因库中排除未知的异质性和最小等位基因频率小于5%的编码单核苷酸多态性（cSNPs）后，选取9个NMDA受体基因的编码SNPs，分别是GRIN2A（rs8049651，rs9806806），GRIN2B（rs7301328，rs35025065，rs1805522，rs1806201，rs1805247）和GRIN2C（rs689730，rs3744215），然后通过SNP分析和PCR扩增对比70例DLS患者和141例正常人之间是否存在上述9种SNPs的差异表达。结果分析发现GRIN2A，GRIN2B和GRIN2C基因与DLS的发生、发展相关性不大，但亚组分析发现GRIN2C基因可能与Cobb角度大小相关，GRIN2B基因可能与侧方滑移程度相关。Kim用同样的方法[12]分析发现突触膜胞吐调节蛋白2（regulating synaptic membrane exocytosis 2,RISM2）基因与DLS的发生、发展存在相关性。RIMS作为调控突触膜胞吐作用的基因，参与Rab3相互作用分子（Rab3-interacting molecules,RIMs）的编码，而RIMs是一种突触前活化区蛋白，在神经递质释放中起重要作用。

早期研究发现，青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）患者的椎间盘内胶原的稳定性比正常对照组明显降低[13]，椎间盘内胶原的缺损可能是脊柱侧凸起始和加重的原因[14]，并且椎间盘髓核组织中存在COL2A1基因编码的Ⅱ型胶原[15]。基于以上基础，Hwang等[16]在SNPs数据库中选取COL2A1基因的SNP（rs2276454），对51例DLS患者和235例正常对照的血液样本进行DNA的提取，PCR扩增后，通过SNP分析发现rs2276454在具有共显性和显性基因型的DLS患者中存在显著性差异，以此推测在韩国人群中COL2A1基因与DLS的发生具有相关性。

目前的研究表明，TMEM163、ANKRD11、NFATC1、GRIN2B、GRIN2C、RIMS2和COL2A1等基因都可能是退变性脊柱侧凸的致病基因。这些可疑的致病基因或是CNVs，或是SNPs。此外，现有研究多为验证性研究，并且也存在样本量少、单中心性研究等不足，无法明确DS的致病基因。退变性脊柱侧凸是否具有遗传性尚缺乏有力的家族或双生子研究证据。

2 Mic roRNA研究及其调控的靶基因和信号转导通路

MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其参与转录后的基因表达调控[17]。MiRNA在多种生理和病理过程中扮演着重要角色，越来越多的研究发现，miRNA在椎间盘退变中发挥重要作用[18-20]。而组织中miRNA的表达谱与DS的发生、发展存在一定联系。Zheng等[21]将DS患者与AIS患者及脊柱爆裂骨折患者作对比，从椎间盘组织、外周血和脑脊液标本中提取RNA，通过实时PCR和蛋白印记技术测定发现，DS患者椎间盘组织、外周血及脑脊液中miR-143的表达水平较AIS和脊柱爆裂骨折患者明显降低，而环氧化酶-2（cyclooxygenase 2,COX-2）的表达水平明显升高。作者根据既往研究中miR-143与COX-2的关系[22]，认为表达下降的miR-143可能通过调控COX-2的表达，导致退变性脊柱侧凸的加剧。

我国学者李浩然等[23]选取DS患者与腰椎骨折患者的椎间盘组织，进行髓核细胞的分离、培养及总RNA的提取，采用miRNA微阵列基因表达和分析技术筛选差异表达的miRNAs，并应用实时PCR技术对其中高表达的miRNAs进行验证。结果发现，DS患者的椎间盘组织中miR-98显著高表达。综合多个数据库的靶基因信息，并取交集分析预测靶基因为白细胞介素10，而该靶基因位于JAK-STAT信号通路的上游并参与其信号转导。因此推测miR-98可能通过调控靶基因白细胞介素10，启动JAK-STAT信号转导通路，在DS的发生发展中发挥重要作用。

王磊等[24]提取DLS患者和腰椎骨折患者髓核组织中的总RNA，进行miRNA Solexa测序筛查，实时PCR技术验证后发现，Has-let-7f在DLS患者椎间盘组织中表达显著下降。经转染髓核细胞实验、Haslet-7f靶基因及信号通路验证发现，下调的Has-let-7f通过调控白细胞介素10/STAT3信号通路，导致椎间盘组织中Ⅱ型胶原的丢失，进而引起椎间盘的退变和退变性腰椎侧凸。该作者还发现miR-491-5p通过调控基质金属蛋白酶9可产生同样的效应[24]。

DS相关的miRNA研究越来越多，研究方法也多种多样。MicroRNA作为一种调控因子参与人体内基因的表达，而现有研究也多表明miRNA通过调控相应靶基因的表达，并通过信号通路的传导最终引起DS的发生。因此，miRNA及其信号传导通路的深入研究将有助于进一步揭露DS的发病机制，而这些miRNA可能成为DS的新的潜在治疗靶点。

3 蛋白质组学及血清生物标记物的探索

为构建DS患者与对照血清差异蛋白质组图谱，Zhu等[26]采集12例DS患者和12例年龄、性别匹配的腰椎管狭窄症（lumbar spinal stenosis,LSS）患者的血清，经过去高丰度蛋白、CyDye染料交叉标记，然后采用荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析技术分别进行蛋白质分离和鉴定，成功鉴定出8个表达显著差异的血清蛋白。它们分别是凝集素（Clusterin，CLU），CLU cDNA FLJ57622，白蛋白（albumin，ALB）cDNA FLJ50830，假定短蛋白（hypothetical short protein），人类白细胞抗原-A（HLA-A MHC class 1 antigen），ALB 23 kDa protein，GPRIN 1（G-蛋白调节的神经轴突生长诱导剂-1）和Ficolin-3。这些差异表达的蛋白可作为DS患者血清中的潜在生物标记物，也可为治疗提供可能的药物靶点。

骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是成骨细胞的干/祖细胞，可分为骨的多种成分[27]。成骨相关的疾病可能发生在干细胞水平，因此在MSCs水平上进行骨骼疾病的研究是非常必要的。Han等[28]分别采集DS患者和年龄、性别相匹配的LSS患者的骨髓，并进行MSCs的提取、培养及裂解。采用2D-DIGE、MALDI-TOF-MS等方法对间充质细胞中的蛋白进行分离与鉴定，最终发现44种蛋白在DS MSCs中差异表达，经蛋白印记技术验证，发现3种蛋白（PIAS2、NDUFA2和TRIM68）上调达4倍以上。活性STAT2蛋白抑制剂（protein inhibitor of activated STAT2,PIAS2）蛋白作为Runx2基因的下游因子影响成骨细胞分化，而Runx2基因变异可导致锁骨颅骨发育不良，而侧凸是该病的重要临床表现；三重基序蛋白68（tripartite motif-containing protein 68, TRIM68）蛋白可作为雄激素受体的共激活剂而影响骨形成或骨重塑。

生物标记物是可以在血液、关节液等生物样本中测得的、反映体内生物化学或者分子变化的指标。在既往研究的基础上[29-32]，Hosogane等[33]利用试剂分析、高效液相色谱分析、酶联免疫吸附等方法分别测定DLS患者和正常对照患者血清中透明质酸（hyaluronic acid,HA）、硫酸软骨素（keratan sulfate, KS）、软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）、Ⅱ型胶原裂解片段（collagen typeⅡcleavage，C2C）和Ⅱ型前胶原C前肽（procollagen typeⅡC-propeptide,CPⅡ）的浓度。结果发现血清中KS、CPII和C2C的浓度在DLS患者中明显升高。CPII和C2C能在一定程度上反映Ⅱ型胶原的合成与降解[34-36]，DLS患者血清中CPⅡ和C2C浓度较高说明Ⅱ型胶原合成和降解的速率较快，且Ⅱ型胶原是髓核组织和关节突关节软骨细胞外基质的主要成分。因此，Ⅱ型胶原的代谢加速可能与退变性腰椎侧凸的发生和进展相关。

蛋白质组的研究主要是利用多种生物学技术对基因表达产物的测定，而血清中蛋白质同样可作为一种生物标记物。蛋白质组学的发展不仅有助于揭示退变性脊柱侧凸的发病机制，也能为DS的早期诊断提供理论依据。但就目前研究现状而言，仍需大量研究进一步阐释这些蛋白的功能通路、特异性及导致DS发生的机制。

综上所述，随着老龄化人口社会的加剧，越来越多的老年人可能罹患退变性脊柱侧凸，将会给老年人带来巨大的痛苦，严重影响生活质量。因此探索退变性脊柱侧凸的发病机制，研究导致疾病产生的基因、蛋白等分子生物学证据十分必要。青少年特发性脊柱侧凸已被证实存在遗传性因素，而尚无明确的分子遗传学证据证实退变性脊柱侧凸是否具有遗传性。目前退变性脊柱侧凸相关的基因、miRNA和蛋白等病因学研究已经取得初步成果，并发现了一些可疑的致病基因、蛋白及调控基因表达的miRNA，为退变性脊柱侧凸的早期诊断和治疗提供了理论依据和可能的药物靶点。但目前仍缺乏家系或者双生子研究证明退变性脊柱侧凸的遗传性，也无法明确退变性脊柱侧凸具体的发病机制，需大量研究探索这一关键问题。

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Basic research progress on the etiology of degenerative scoliosis

LIU Yongsheng,ZHAO Yu*
(Department of Orthopedic Surgery,Peking Union Medical College Hospital,CAMS&PUMC,Beijing 100730,China)

Degenerative scoliosis(DS)is a coronal deviation of the spine that is prevalent in the elderly and seriously affects the quality of life,but the exact etiology remains unclear.With the development of molecular biological techniques, scholars at home and abroad have made great progress in the basic research of etiology of DS,laying the foundation for further clarifying the pathogenesis and therapeutic targets,especially in genes,microRNA,and proteins.In this paper,we reviewed the basic researches on the etiology of degenerative scoliosis,and hoped to provide the data for the next study.

Degenerative Scoliosis;Etiology;Gene;MicroRNA;Protein

2095-9958（2017）04-0159-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.02-16

*通信作者：赵宇，E-mail：zhaoyupumch@163.com