程序死亡配体1在胰腺癌中的研究进展

沈祥国 苏长青 李兆申 陈向荣 徐灿

程序死亡配体1在胰腺癌中的研究进展

沈祥国 苏长青 李兆申 陈向荣 徐灿

胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，具有恶性程度高、致死率高等特点，大多数患者初诊时已无外科根治手术条件，现有的各种治疗手段效果不甚理想。目前，肿瘤的精准治疗是研究热点，而肿瘤免疫治疗作为新型治疗手段成为研究热点之一。程序死亡配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)及其受体程序死亡受体1(programmed death-1，PD-1)是体内广泛存在的负性免疫调节信号通路。这一通路在多种肿瘤中异常表达，对肿瘤生物学过程起到促进作用。PD-L1及PD-1单克隆抗体均已进入临床，并在黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等肿瘤中取得疗效。本文就PD-L1在胰腺癌生物学过程中的作用及相关研究进展做一综述。

一、PD-L1/PD-1信号通路

PD-L1/PD-1通路是健康人体内重要的负性免疫调节通路，可抑制淋巴细胞增殖、抗原提呈和细胞因子分泌。PD-L1可以在T细胞、B细胞、单核细胞、抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs)和上皮细胞中表达，在胸腺、心、肺等组织中高表达。APCs表面PD-L1表达水平决定T细胞活化水平，进而决定免疫耐受与自身免疫反应之间的阈值[1-3]。阻断PD-L1，可在杀伤肿瘤同时维持体内免疫稳态。由于存在其他亚型，单独PD-1主要在抗原刺激后的记忆型T细胞表达，也可在B细胞、DC细胞、NK细胞和单核细胞上表达。内源性抗原刺激时，PD-1迅速升高以避免有害自身免疫反应；内源性抗原清除后，PD-1迅速消退，恢复正常免疫反应阈值[2]。故PD-L1/PD-1表达异常也常见于各类自身免疫性疾病[4-7]。

PD-L1分为膜型(membrane PD-L1, mPD-L1)和可溶型(soluble PD-L1, sPD-L1)，目前认为sPD-L1是mPD-L1有生物学活性的片段[8]。健康人群血清sPD-L1水平与年龄正相关[8]，提示可能和老龄人群免疫功能下降有关。所以，PD-L1/PD-1通路作用范围并非局限于细胞间直接接触，还应认识到sPD-L1作为细胞因子在全身免疫调节中的作用。

二、PD-L1与胰腺癌

1．PD-L1的作用机制：Loos等[9]研究发现，胰腺癌和癌旁组织PD-L1基因水平检测差异无统计学意义(100%比94.7%)，但转录水平胰腺癌组织PD-L1 mRNA表达是癌旁组织2.8倍，翻译后PD-L1蛋白仅在胰腺癌组织中表达。这提示胰腺癌PD-L1表达主要受到转录、翻译水平调控。涉及PD-L1的调控机制包括PI3K/Akt、MAPK信号通路，HIF-1、STAT3、NF-κB转录因子，miR-513、miR-570、miR-34a、miR-197和miR-200等[2]。其中STAT3转录因子是多种调节机制的交汇点，而上述miRNAs均负性调节PD-L1表达。在巨噬细胞和树突细胞中过表达的miR-24、miR-30b 和 miR-142-3p可以上调PD-L1表达，抑制其抗原摄取与提呈能力[10]。

IFN-γ是重要的PD-L1表达诱导因子，可诱导多种肿瘤细胞PD-L1表达增加并呈剂量依赖关系[11-12]。研究提示，与TILs交界处肿瘤细胞PD-L1表达阳性率高，可能与TILs细胞因子分泌相关[13]。IFN-γ虽然是重要的炎性反应和肿瘤杀伤因子，但是其对PD-L1的诱导作用使其在肿瘤免疫中具有两面性。PD-L1表达增加后，效应T细胞受到抑制，IFN-γ表达下降。MPDL3280A临床试验[14]中发现，药物阻断PD-1/PD-L1通路，IFN-γ水平显著恢复，同时PD-L1表达水平显著增加，且ΔIFN-γ与ΔPD-L1正相关。Lee等[15]发现，在肺癌细胞A549的PD-L1启动子中存在干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)，IFN-γ通过对IRF-1的持续激活促进PD-L1表达。这一过程可被JAK/STAT信号通路抑制剂阻断。IFN-γ可能是肿瘤免疫激活与免疫抑制启动之间的关联点，PD-L1则是免疫抑制启动因子[16]。体外实验中，胰腺癌PANC1细胞PD-L1表达与IFN-γ呈剂量依赖性[11]；而STAT3 信号被miR-155刺激增加后，胰腺癌细胞PANC1和Capan-2的侵袭和迁移能力得到加强[17]。miR-34a、miR-200、miR-155在胰腺癌患者外周血及组织中较健康人群存在显著性差异[18-19]。以上均提示PD-L1相关调控机制在胰腺癌生物过程中有着显著变化。

胰腺癌患者常伴有糖尿病，说明糖尿病与胰腺癌关系密切。糖尿病患者人体内糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)较健康人群显著升高。研究发现AGEs促进PaTu8988胰腺癌细胞PD-L1表达[20]。

2．PD-L1在胰腺癌中表达的意义：研究报道胰腺癌组织中PD-L1表达增高，但总体低于非小细胞肺癌、黑色素瘤等。日本Nomi等[21]发现，39%(20/51)胰腺癌患者PD-L1表达升高。Herbst等[14]对胰腺癌石蜡切片免疫组化染色后发现，PD-L1阳性率(阳性细胞>5%细胞总数，淋巴细胞和肿瘤细胞分别计数)较低，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)14.5%(12/83)，胰腺癌细胞4.8%(4/83)。同一实验中非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌等肿瘤组织中PD-L1阳性率显著高于胰腺癌。以我国胰腺癌石蜡切片为样本的研究，上海仁济医院[22]28.7%(27/94)、苏州大学第一附属医院[23]57.1%(36/63)的样本PD-L1升高。虽然阳性标准存在差异，但总体较Herbst等[14]的结果显著增高，且较之非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌组织中PD-L1肿瘤细胞53%～89%、TILs 50%～100%的阳性率低[24]。免疫组化PD-L1阳性率的差异性主要受到各种实验因素影响[25]，但各项实验均认为胰腺癌组织PD-L1表达水平和胰腺癌术后总体生存率负相关[21-23]，是不良预后因子。不同人种之间胰腺癌组织PD-L1表达是否存在差异有待进一步扩大研究规模。

胰腺癌患者外周循环中sPD-L1表达阳性率为4.8%～57.1%[8,14-16]，但与癌组织mPD-L1相关性、影响因素及临床意义未见研究报道。笔者尚未发表的胰腺癌外周循环sPD-L1研究提示，sPD-L1在胰腺癌生物学过程中存在显著差异性表达，与肿瘤进展、转移显著相关。

三、PD-L1单抗治疗胰腺癌现状

PD-L1单抗经美国FDA批准用于黑色素瘤、小细胞肺癌治疗。2016年PD-L1抗体Atezolizumab(商品名Tecentriq，试验代号MPDL3280A)首次获得FDA批准用于尿路上皮癌二线治疗[26]，并在申请非小细胞肺癌二线治疗。另有多种PD-L1单克隆抗体(MEDI4736、BMS-936559等)目前正在进行临床试验[27-28]。虽然PD-L1在部分胰腺癌患者组织中表达增高，但是现有资料提示单用PD-L1单抗治疗胰腺癌效果不佳。MPDL3280A临床试验中[14]，5例胰腺癌患者参加，1例符合统计要求，客观缓解率为0。BMS-936559是完全人源性PD-L1 IgG4 单克隆抗体，临床试验中14例晚期胰腺癌未获得客观缓解[28]。但是，MPDL3280A最近在日本人群中的Ⅰa期剂量安全性试验中显示1例晚期胰腺癌患者(TILs阳性率1%～5%之间，肿瘤细胞阳性率<1%)获得了12.2个月的无进展生存期，且剂量仅为10 mg· kg-1· 3周-1，低于20 mg· kg-1· 3周-1的标准剂量，总剂量也小于说明书的单次1 200 mg/20 ml[3]。

PD-L1治疗胰腺癌疗效不佳可能与以下因素相关：首先，肿瘤组织PD-L1表达阳性率是目前PD-1/PD-L1单抗治疗人群筛选的重要依据，但尚未建立统一评价标准。受检测技术、试剂、治疗状况以及PD-L1表达动态变化等因素影响，癌组织PD-L1检测准确性、可靠性受到限制[25,13]。免疫组化选材时应保证组织样本充足，尽量选取初诊样本、肿瘤与TILs交界部位进行染色，有条件应同时进行转移灶检测并评估相同样本TILs浸润情况[13]。Atezolizumab临床试验中发现，TILs PD-L1阳性率和有效应答之间存在相关性(P=0.007)，与肿瘤细胞PD-L1阳性率无明显相关(P=0.079)[14]。对于PD-L1抗体治疗效果不佳的各类肿瘤标本进行分析[14]，发现具有相类似的特点：缺乏TILs浸润； TILs PD-L1低表达或不表达；免疫细胞仅在肿瘤组织周围浸润。有研究[21]认为胰腺癌组织中CD8+T细胞分布和PD-L1分布呈负相关，符合理论上PD-L1可以诱导T淋巴细胞凋亡。实际操作中，无手术指征晚期胰腺癌病理组织获取困难，EUS-FNA样本量少、癌细胞发现率较低，均影响PD-L1免疫组化检测结果。部分免疫组化PD-L1阴性患者也有确实疗效，故PD-L1免疫组化可能并非单一患者筛选指标[13]。其次，生物单抗类制剂自身药物特点。此类药物，如治疗克罗恩病的TNF-α单抗(英夫利昔单抗等)，静脉用药会与循环目标抗原结合。如循环目标抗原浓度过高，可导致病灶药物浓度不足；而长期使用英夫利昔单抗可能产生抗抗体，加速药物中和，缩短药物谷浓度维持时间。PD-L1单抗静脉用药尚未见相关研究资料。第三，胰腺癌组织特点为乏血供、纤维组织含量较多，纤维组织分割包裹癌组织，静脉药物难以充分进入病灶。以上这些因素均可能影响PD-L1单抗对胰腺癌的治疗效果。

安全性方面，Atezolizuma在日本人群中的剂量20 mg·kg-1· 3周-1安全有效，和美国人群研究无差异[3]。Atezolizuma说明书(Reference ID：3934412)明确指出Ⅰ型糖尿病伴3级高血压、自身免疫性胰腺炎患者用药均应谨慎，且药物诱发自身免疫性胰腺炎的概率是0.1%(2/1978)。

四、PD-L1在胰腺癌治疗中的方向

联合治疗、协同克服制约因素，是PD-L1靶点在胰腺癌治疗中的方向。在小鼠原位胰腺癌模型上发现[29]，剔除肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)，阻止成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)表达，PD-L1抗体疗效显著提高。FAP+CAF分泌的趋化因子配体12(CXCL12)，屏蔽了趋化因子，抑制了T细胞向胰腺癌组织浸润。使用CXCL12受体4抑制剂(AMD3100)，可以促进T细胞浸润并增强PD-L1单抗疗效。

人胰腺癌组织中有较多T细胞浸润，且多为CD45+，具有IFN-γ分泌功能[16]。由此推断，免疫功能抑制较抑制淋巴细胞浸润可能更加重要。胰腺癌肿瘤微环境中的相关免疫抑制机制有：胰腺癌组织较外周血单核细胞(PBMC)中CD4+FOXP3+Treg细胞和分泌IL-17的CD8+T细胞显著增多，促进肿瘤浸润T细胞PD-1表达显著增加，负性调节加强；低分化标本中骨髓抑制细胞和Treg细胞比例更高等[16,30]。在CTLA-4单抗治疗黑色素瘤的研究中发现，起主要作用的是内源性肿瘤反应T细胞激活，而激活的T细胞会受到其他免疫抑制机制抑制[31]。联合使用不同机制的肿瘤免疫疗法会获得协同效应。目前，针对黑色素瘤的大规模、多中心研究也证实了联合免疫治疗的协同疗效[31-32]。

基于以上观点，未来肿瘤免疫治疗方向应是联合治疗。PD-L1/PD-1单抗可联合其他治疗方式，如化疗、CTLA-4单抗、肿瘤疫苗、联合新辅助治疗、CD40激动剂抗体 (αCD40)等[2,23,30,33-34]，增强胰腺癌组织免疫源性、降低Treg细胞和髓系抑制细胞比例，提高疗效。

综上所述，PD-L1在部分患者胰腺癌组织中高表达，并受到包括IFN-γ、miRNAs在内的多种细胞因子和信号通路调控。目前有限研究数据显示东亚人群胰腺癌组织PD-L1阳性率可能高于欧美人群、PD-L1单抗可能对于胰腺癌患者有效、安全。进一步研究PD-L1在胰腺癌进展、转移、全身免疫抑制过程中的作用、相关调节机制及人种表达差异性，有助于了解胰腺癌免疫抑制状态产生的原因及演变过程，并为胰腺癌免疫治疗寻找新的思路与方向。

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(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.05.020

国家自然科学基金(81372673)；上海市浦江人才计划项目(14PJD004)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科(沈祥国、李兆申、徐灿)；东方肝胆医院分子肿瘤实验室(苏长青)；海军91801部队卫生队(陈向荣)

徐灿，Email：xxcc211@126.com

2016-10-28)