金针菇菌株农艺性状评价与遗传差异分析

谭 艳，王 波，赵瑞琳

(1. 四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)

金针菇菌株农艺性状评价与遗传差异分析

谭 艳1，2，王 波1*，赵瑞琳2

(1. 四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)

利用ISSR技术对29个金针菇菌株进行了遗传多样性和农艺性状分析，建立了遗传相似性聚类图和农艺性状指标。结果表明，29个金针菇菌株遗传相似性水平在0.67～0.89，在0.67水平上29个菌株被聚为一个类群，在遗传相似性水平为0.70上，将29个金针菇菌株分为4个大类群；在农艺性状上存在较大差异，产量上分为高产类、中产类和低产类，生育期上分为早熟和晚熟两类，子实体形态特征上分为黄色和白色、粗柄和细柄、基部绒毛分为有和无，建立了金针菇主要农艺性状指标。

金针菇；遗传多样性；分子标记；产量；形态特征

金针菇是中国主要栽培食用菌之一，年生产量达到240万余t(2012)，居栽培食用菌中第4位，生产上使用的金针菇品种分为黄色和白色两大类，工厂化栽培品种为白色、农业栽培品种以黄色为主，因此，开展研究金针菇种质资源遗传背景在金针菇育种和生产上具有重要意义，在金针菇种质资源遗传分析上已开展了研究工作，对金针菇菌株的遗传多样性进行分析，分别开展了RAPD、SRAP、ISSR和酯酶同工酶等[1-5]，分子标记技术已广泛应用在食用菌的遗传多样性分析上，其中利用较多的分子标记为ISSR， ISSR是由Zietkiewicz et al.1994年创建的一种DNA标记技术，与RFLP、RAPD等其它DNA检测技术相比，该技术根据真核生物中广泛存在简单重复序列的特点，利用在真核生物基因组中常出现的简单重复序列本身设计引物，无需预先克隆和测序。简单重复序列通常为显性标记具有很好的稳定性和多态性。ISSR标记已应用到食用菌种质资源鉴定、遗传多样性分析、特异标记等方面[6-14]；金针菇菌株农艺性状也是反映其遗传多样性的重要指标，特别是金针菇产量、生育期，以及子实体颜色、菌柄大小、菌柄基部有无绒毛等重要指标是反映金针菇菌株是否优良的标准，国内外在金针菇菌株的农艺性状指标建立上还不完善，为此，有必要开展金针菇菌株的遗传多样性和农业性状分析，从分子生物学和传统农艺性状上综合评价金针菇菌株，更能反映金针菇菌株间遗传差异，对遗传育种研究和生产应用具有重要意义。

表1 供试金针菇菌株与来源

1 材料与方法

1.1 供试菌株与来源

供试菌株与来源见表1所示。

1.2 遗传差异分析

1.2.1 菌种培养与DNA提取 不同菌株在液体培养基(配方：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然)中培养10 d后，收集菌丝体，加入液氮研磨成粉末后，采用CTAB法提取DNA。

1.2.2 ISSR-PCR扩增 试验用ISSR引物见表2所示。20 μl PCR扩增反应体系：1 μl DNA模板，1 μl Primer，10 μl 2×PCR Master Mix，8 μl ddH2O。PCR扩增反应程序为：94 ℃充分变性2.5 min，然后进行10个循环；94 ℃变性45 s，57 ℃(温度随引物变化)退火50 s，72 ℃延伸2 min，接着进行35个循环；94 ℃变性45 s，47 ℃(温度随引物变化)退火50 s，72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸5 min，10 ℃终止反应。PCR产物在1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳， GoldView染色，以DNA Marker DL2000(大连宝生物工程有限公司)作为分子量标准，用美国Bio-RAD凝胶成像系统照相。

1.2.3 电泳检测 取6 μl ISSR扩增产物和1 μl

表2 ISSR扩增所用引物

0.25 %的溴酚蓝上样缓冲液混匀，进行1.6 %琼脂糖凝胶电泳(含DNAGoldViewTM DNA染料)电泳，4～5 v/cm恒压电泳40 min，然后通过紫外凝胶成像系统观察并照像。

1.2.4 数据处理 将ISSR扩增片段进行统计，有ISSR谱带计为1，无ISSR谱带计为0，构建初始数据矩阵，用NTSYSpc2. 1专业版软件计算遗传相似系数(Nei& Li系数)，以平均连锁法(UPGMA)进行聚类分析，得出聚类图谱。

1.3 农艺性状测试

用22 cm×33 cm规格的聚丙烯塑料袋装培养基(棉籽壳40 %，棉渣35 %，麸皮15 %，玉米粉8 %，石灰2 %。)，常压灭菌后，无菌接入栽培种，每个菌株栽培30袋，设3个重复，每个重复10袋，22～25 ℃下培养，待菌丝体生长满袋后，按常规方法进行出菇管理，出菇温度为10～15 ℃，以采收2潮菇的产量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 电泳图谱

用8个引物分析了29个金针菇菌株，共扩增出991个片段，大小在100～2 000 bp，其中多态性片段为788个，多态性比率为79.52 %，其中引物18扩增片段如图1所示，说明不同金针菇菌株间存在丰富的遗传多样性，遗传变异水平高。

2.2 聚类分析与遗传多样性分析

从ISSR聚类树状图可知，29个金针菇菌株遗传相似性水平在0.67～0.89，在0.67水平上29个菌株聚为一个类群，在遗传相似性水平为0.70上，将29个金针菇菌株分为4个大类群，类群Ⅰ包括1个菌株，类群Ⅱ包括2个菌株，类群Ⅲ包括24个菌株，类群Ⅳ包括2个菌株；29个金针菇菌株中明金1号与其它菌株杂交遗传差异较大，遗传相似系数为0.67水平，聚为1类群；遗传相似性水平最高的为0.89，为川金6号与F212；5个野生菌株分别在类群Ⅱ和类群Ⅲ，位于类群Ⅱ的野生菌株与栽培菌株遗传差异最大(图2)。

M:引物 M:Marker图1 引物18对金针菇供试菌株扩增的ISSR 电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of Flammulina velutipes strains amplified with 18# ISSR primer

图2 用8个ISSR引物扩增的29个金针菇菌株聚类图Fig.2 Dendrogram on 29 strains of Flammulina velutipes with 8 ISSR primers

2.3 农艺性状评价

2.3.1 生育期与产量分析 对29个菌株进行分析，结果表明，生育期在54～67 d，相差13 d，可将29个金针菇菌株分为早熟和晚熟2类，早熟的生育期在54～57 d，晚熟的生育期为65～67 d，平均产量在346.56～533.38 g/袋，生物学效率在59.72 %～88.90 %(表2)，根据产量可将金针菇29个菌株分为高产类、中产类和低产类，生物学效率85 %以上的为高产类、71 %～84 %为中产类， 70 %以下的为低产类，29个菌株中高产类占17.2 %，中产类占65.6 % %，低产类占17.2 %。

表2 金针菇29个菌株生育期与产量比较

续表2 Continued table 2

菌株Strains生育期(d)Growthperiod平均产量(g/袋)Averageyield生物学效率(%)Biologicalefficiency显著差异Significantlydifferentlevels0.050.01F6124957438.5673.09efghDEFG江山白菇65436.5072.75efghDEFG川金4号54436.4472.74efghDEFG金杂1957432.0072.00efghDEFGF215357431.9371.99efghDEFGF710157427.8571.31fghEFGFNK130266415.7469.29ghFGHF61154412.3168.72hGH金白F467406.7567.79hGHIFKS120265358.3059.72iHIF90254346.5657.76iI

2.3.2 子实体主要性状 29个金针菇菌株子实体颜色分为黄色和白色2大类，其中前者有22个，后者有 7个，黄色金针菇菌株中菌盖颜色分为黄色和浅黄色2类，其中前者有22个，后者有7个；子实体菌柄大小分为粗柄型和细柄型2大类，其中前者有24个，后者有5个；黄色金针菇菌株中菌柄颜色分为浅黄色和黄白色2大类，其中前者有16个，后者有5个，白色金针菇菌株的菌盖和菌柄均为白色，并且不受光照影响(表3)。

表3 金针菇子实体形态特征

续表3 Continued table 3

菌株Strains形态特征 Morphologicalcharacteristics菌盖颜色Colorofcap菌柄类型Typeofstipe菌柄颜色Colorofstipe绒毛Fluff川金4号浅黄色粗柄型浅黄色无金杂19浅黄色细柄型黄白色有F2153浅黄色细柄型黄白色有F7101黄色粗柄型浅黄色有FNK1302白色细柄型白色有F611黄色粗柄型浅黄色有金白F4白色粗柄型白色有FKS1202白色粗柄型白色有F902黄色粗柄型浅黄色有

3 讨 论

3.1 金针菇菌株遗传多样性

利用ISSR分子标记对金针菇29个菌株的遗传多样性进行分析，能显示其菌种间遗传差异，除白色金针菇FKS1202与供试的其它菌株遗传差异较大外，其余白色金针菇菌株与黄色金针菇菌株还不能区别开来，如果要建立金针菇农艺性状与分子标记的相关性，需要进一步开发分子标记。建立农艺性状与分子标记的相关性，对开展金针菇遗传育种具有重要作用。有关农艺性状的标记，只在白色金针菇的白色性状上建立了SCAR特异性标记，利用该标记能鉴定出黄色和白色性状[15]。

3.2 金针菇菌株农艺性状

29个金针菇菌株在农艺性状上存在多样性，颜色上分为黄色和白色两大类，黄色金针菇菌株又可分为黄色和浅黄色两类，浅黄色金针菇菌株可能是黄色金针菇菌株与白色金针菇菌株间杂交选育的，如川金菇3号和川金6号是以黄色金针菇与白色金针菇杂交选育的品种，子实体颜色为浅黄色；金针菇菌株在生育期上存在较大差异，可分为早熟和晚熟两大类，黄色金针菇菌株均为早熟类型，白色金针菇有早熟和晚熟两类，早熟白色金针菇菌株川金5号和F3W4为早熟黄色金针菇菌株与晚熟白色金针菇菌株杂交选育的，具有早熟黄色金针菇的特性，但子实体颜色为白色[16]；金针菇子实体菌柄性状是重要的商品性状之一，生产上使用的优良金针菇菌株菌柄粗壮、颜色近白色或者白色、基部无绒毛。建立金针菇菌株子实体性状指标对开展金针菇品种选育具有重要作用。金针菇栽培模式多种多样，分为农业栽培模式、人工控制温度下的设施栽培模式和工厂化栽培模式等，不同栽培模式适宜不同的栽培品种。供试的29个金针菇菌株还需在不同栽培模式下进行试验，对其产量、生育期和子实体形态特征进行测试，以确定其适宜的栽培模式，为选育适宜不同栽培模式下的金针菇菌株提供育种材料。

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(责任编辑 陈 虹)

Evaluation of Agronomic Traits and Analysis of Genetic Diversity forFlammulinavelutipes

TAN Yan1,2,WANG Bo2*,ZHAO Rui-lin1

(1. Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China； 2.College of Forestry, Southwest Forestry University, Yunnan Kunming 650224, China)

We had established genetic comparability dendrogram and agronomic traits index by means of analyzing the genetic diversity and agronomic traits of 29Flammulinavelutipesstrains by ISSR, the results showed that the genetic comparability coefficient was between 0.67 and 0.89. They were clustered one group at comparability coefficient 0.67 while four groups at 0.89. There ware conspicuous differences in agronomic traits, high, middle and low in the yield, early maturing and late maturing in the growth period, some traits of the fruit body, such as yellow or white on the color, thick or thin of the stipe, with the fluff or not on the stem base, which helped to establish the major agronomic traits index ofFlammulinavelutipes.

Flammulinavelutipes; Genetic diversity; Gonocular marker; Yield; Morphological characteristics

1001-4829(2016)12-2965-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.035

2014-09-02

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-24)

谭 艳(1988-)，女，在读硕士研究生，从事食用菌遗传育种研究，E-mali:snjtanyan@yeah.net，*为通讯作者，E-mail:4504292@163.com。

S646.1+5

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