蒙自葡萄根际土壤寄生线虫的种类初步鉴定

林丽飞，潘云梅，杨 丽，龙耀云，胡先奇*

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.上海海洋大学生物系，上海 200090；3.云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南红河学院，云南 蒙自 661100)

蒙自葡萄根际土壤寄生线虫的种类初步鉴定

林丽飞1，潘云梅1，杨 丽2，龙耀云3，胡先奇1*

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.上海海洋大学生物系，上海 200090；3.云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南红河学院，云南 蒙自 661100)

从2014年10月至2015年2月到蒙自市文澜落龙庄、草坝营房、草坝六村、草坝十七村等葡萄地进行实地调查，采用五点取样法，选取地上部分生长势弱、叶发黄或根部出现变褐萎蔫等症状的植株，采取其根际周围2 kg的土样，共采集28份土样。通过形态鉴定的方法，对蒙自葡萄根际土壤寄生线虫的种类进行初步鉴定，通过实验初步鉴定出葡萄寄生线虫3属4种，分别是燕麦真滑刃线虫(AphelenchusavenaeBastian,1865)、肾状肾形线虫(RotylenchulusreniformisLinford et Oliverira,1940)、双宫螺旋线虫[Helicotylenchusdihytera(Cobb，1893)Sher,1961]、假强壮螺旋线虫[Helicotylenchuspseudorobustus(Steiner，1914) Golden,1956]。

葡萄；线虫；种类；鉴定

葡萄(V.viniferalL.)属于被子植物门，鼠李目，葡萄科，葡萄属的多年生草本植物，别名草龙珠、菩提子、山葫芦、蒲桃等，原产于西亚，张骞出使西域时带回种植，在中国已有2000多年的种植历史[1]。葡萄属有60 余种，分布于世界温带或亚热带，中国有37 种[2-3]。葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高，具有抗病毒，杀细菌；改善过敏症状，防癌抗癌；抗贫血等保健功能[4-6]。葡萄作为多年生植物，有发达的根系，为生活在土壤中的寄生线虫提供了良好的生存条件。

国外对于葡萄寄生线虫的研究较早，发展迅速。1999年J. N. Pinkerton[7]等在对美国俄勒冈州葡萄病害的研究中发现，植物寄生线虫存在于葡萄根系，通过对俄勒冈州西部的70个葡萄园进行采样研究，确定了该州葡萄寄生线的4个属：剑线虫属、短体线虫属、异盘中环线虫属、针线虫属及其分布情况。

中国对于葡萄寄生线虫的研究起步较晚，孙严、王寿华[8]调查了新疆吐鲁番的葡萄根围线虫种类，通过对5个品种葡萄根围50份土样中的线虫进行分离和鉴定，确定了8种主要的葡萄寄生线虫。王杰[9]等对安徽省葡萄寄生线虫种类进行调查，鉴定出11个属的12种葡萄寄生线虫。于春池[10]等对河北省果树寄生线虫种类调查后，鉴定出14个属的7种葡萄根围线虫。谢成伦[11]等对四川省葡萄寄生线虫种类进行调查，报道了12个属的21种葡萄寄生线虫及其分布。邓大林[12]等在对四川省主要果树寄生线虫研究中又发现2个属的葡萄寄生线虫。本研究对云南蒙自葡萄寄生线虫种类进行初步的调查和研究，对优势种群进行鉴定，为葡萄病害病原物的研究提供新内容，为葡萄寄生线虫的资源调查和防治提供科学的理论依据，对进一步全面开展蒙自市葡萄寄生线虫种类研究起到积极的推动作用。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

从2014年10月至2015年2月到蒙自文澜，草坝六村、十七村、营房等主要葡萄种植区选取地上部生长势弱、根部出现变褐、萎蔫等症状的植株采用五点采样法采集土壤样品。采集其根围四周对称的土样，去掉上层肥土，向下挖距离地表面20～30 cm以下(可根据条件适当改变深度，挖取较湿润的土壤)的土壤或介质样本，每株采集2 kg左右的土壤或介质样本，放入封口塑料袋中，并做好标记。将样品带回实验室及时分离或在4 ℃的冰箱内保存、待用。

1.2 线虫的分离、杀死与固定[13]

具体方法参照文献[14]的方法，线虫的分离采用直接剥离法或贝曼漏斗法。获得的线虫置于65 ℃热水浴3～5 min，杀死线虫，已杀死的线虫必须及时用4 %的福尔马林固定液固定，以保持线虫形态不变和内部器官的清晰，防止虫体腐烂，便于观察鉴定和长期保存。

1.3 线虫的形态鉴定

本实验分类鉴定主要依照谢辉的分类系统[15]，把制作好的线虫玻片放在显微镜下观测，进行形态的鉴定、测量、描述及拍照。形态测量值的计算用De Man公式(测量值的长度单位均为μm)。

2 结果与分析

2.1 燕麦真滑刃线虫(Aphelenchoides avenae Bastian,1865)

分类地位：滑刃目(Aphelenchida siddiqi,1980)、真滑刃科[Aphelenchidae(Fuchs,1937)Steiner,1949]、真滑刃亚科(Aphelenchidae Frchs,1937)、真滑刃属(AphelenchusBastian,1865)。

分布地区：云南省蒙自市文澜落龙庄、草坝营房、六村、十七村。文中虫体的测量值与文献记述的比较见表1。

形态描述(图1)。雌虫：虫体圆筒形，两端稍变细，热杀死后稍向腹面弯曲，体表环纹细。唇区低，前段平圆，略缢缩，口针较细，基部球膨大；食道前体部圆柱形，中食道球大，呈卵圆形；食道峡部很短，食道腺长叶状，从背面覆盖肠；阴门横裂，位于体中后部阴门唇略突起，虫体在阴门以后常明显变细；单生殖腺，前伸，后阴子宫囊约为阴门处体宽的3倍，尾较短，圆筒形，末端半圆或宽圆形。

表1 葡萄根部燕麦真滑刃线虫的测量值与文献记述的比较

续表1 Continued table 1

形态指标Diagnosticcharacter测量种群PopulationofMengzi雌虫Female文献Literature[16]雌虫Female文献Literature[17]雌虫Femaleb4.1±0.7(3.2～5.4)4.1～6.24.9～7.0b'3.7±0.4(3.0～4.5)2.8～5.4c26.7±3.1(22.4～33.8)22～3125.5～37.5c'1.7±0.2(1.5～2.2)1.5～2.7v76.2±2.9(69.7～80.9)68～7875.0～81.0v'79.3±2.3(72.6～82.4)Bulb1.4±0.2(1.2～1.8)MB12.2±1.2(10.4～14.4)

雄虫：未见。该种群的形态特征与测量数据，与文献[16]和文献[17]中对燕麦真滑刃线虫的记述基本相同，故此定名。但该线虫的b值(体长/体前端至食道与肠连接处的距离)与文献[16]、[17]相比较小。

A.雌虫整体；B.雌虫头部；C.阴门；D.雌虫尾部；墨线图(a.雌虫头部；b.阴门；c.尾部)A. Entire view of female; B. Female anterior; C. Vulva; D. Female posterior; Drawings for nematode(A. Female anterior; B. Vulva; C. Female posterior)图1 燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae Bastian，1865)Fig.1 Aphelenchus avenae

2.2 肾状肾形线虫(Rotylenchulus reniformis Linford et Oliverira,1940)

分类地位：垫刃目(Tylenchida)、纽带科(Hoplolaimidae Filipjev,1934)、肾状亚科(Rotylenchulinae)、肾状属(RotylenchulusLinford et Oliverira,1940)。

A.雌虫整体；B.雄虫整体；C.雌虫头部；D.阴门；E.雌虫尾部；F.雄虫尾部；墨线图(a.雌虫头部；b.阴门；c.雌虫尾部；d.雄虫尾部)A.Entire view of female; B. Entire view of male; C. Female anterior; D. Vulva; D. Female posterior; E. Male posterior; Drawings for nematode(A. Female anterior; B. Vulva; C. Female posterior; D. Male posterior)图2 肾状肾形线虫(Rotylenchulus reniformis Linford et Oliverira, 1940)Fig.2 Rotylenchulus reniformis

形态指标Diagnosticcharacter测量种群PopulationofMengzi文献Literature[16]雌虫Female雄虫Male雌虫Female雄虫Malen175L425.0±30.1(372.5～470.0)416.0±44.5(365.0～462.5)300～660350～530BW18.5±1.3(17.5～20.0)17.5Ant.tip-junction132.2±13.5(102.5～147.5)94.0±3.4(90.0～97.5)Ant.tip-gland153,2±12.7(122.5～170)104.5±3.3(102.5～110.0)Tail32.3±3.2(27.5～37.5)24.5±2.7(22.5～27.5)27～52Aw11.5±1.3(10.0～12.5)10Ant.tip-vulva293.2±22.6(257.5～322.5)Stylet17.7±0.8(16.3～18.8)14.0±1.4(12.5～15.0)18～2015～16DGO14.9±1.8(12.5～17.5)10～15Spicule17.0±2.1(15.0～20.0)18～23Gubernaculum7.57～8a23.5±2.9(18.6～30.5)23.8±2.5(20.6～26.4)21～3323～38b3.2±0.2(2.8～3.7)4.4±0.5(3.7～4.8)2.4～4.32.9～5.6b'2.8±0.2(2.3～3.1)4.0±0.4(3.5～4.4)2.3～4.03.1～5.0c13.3±1.2(11.4～15.4)17.0±1.6(15.7～19.9)11～1814～22c'2.8±0.4(2.2～3.8)2.5±0.3(2.3～2.8)1.8～3.41.8～3.3v69.1±3.9(63.3～76.3)63～77

分布地区：云南省蒙自市文澜落龙庄、草坝营房、六村、十七村。

本文虫体的测量值与文献记述的比较见表2。

形态描述(图2)。未成熟雌虫：虫体细长, 呈C 形, 或开放的螺旋形。唇区高，圆锥形，连续，头架骨化强；侧区有4条刻线，无网格：口针强壮，口针基部球圆形，向后倾斜；背食道腺开口于口针基部球后13～33 μm；中食道球椭圆形，食道瓣门发达且凸出;食道腺从腹面和侧面覆盖肠；排泄孔位于食道陕部，紧靠半月体之后；阴门不突出；双生殖腺，对生，转折；尾长圆锥形，渐变窄，有明显的透明端部。

雄虫：蠕虫形，口针和食道退化，中食道球不发达，食道瓣门不清晰；交合刺细长，向腹弯弯成弓形；引带线形，不突出；交合伞不显著，不完全伸到尾端。

该线虫的形态特征与测量数据与文献[18]对肾状肾形线虫的记述基本相同，故此定名。与文献[18]相比，本文中雄虫的尾长与a值(体长/最大体宽)均较小。

2.3 双宫螺旋线虫[Helicotylenchus dihytera(Cobb，1893)Sher, 1961]

分类地位：垫刃目(Tylenchida)、垫刃亚目(Tylenina Chitwood,1950)、纽带科(Hoplolaimidae Filipjev,1934)、纽带亚科(Hoplolaiminae Filipjev,1934)、螺旋属(HelicotylenchusSteiner,1945)。

分布地区：云南省蒙自市文澜落龙庄、草坝营房、六村。

本文虫体的测量值与文献记述的比较见表3。

形态描述(图3)。雌虫：经热水浴杀死后，虫体一般呈螺旋形；体环明显，侧区有4条刻线；头部连续略缢缩，端圆或平；唇区半球形，口针强壮，口针基部球前缘平，后食道腺。

背腹覆盖肠，腹面长覆盖；半月体位于排泄孔水平处；阴门凹陷，双生殖腺，对伸，受精囊连续或稍稍缢缩，无精子；尾呈不对称圆锥形，向腹面弯曲，背弯弧大，通常具有尾腹突，腹突一般不超过2个体环的长度。

雄虫：未见。该线虫的形态特征与测量数据与文献[19]和文献[20]对双宫螺旋线虫的记述基本相同，故此定名。与文献相比，文中的线虫口针基部球宽稍大。

2.4 假强壮螺旋线虫[Helicotylenchus pseudorobustus ( Steiner，1914) Golden, 1956]

分类地位：垫刃目(Tylenchida)、垫刃亚目(Tylenina Chitwood,1950)、纽带科(Hoplolaimidae Filipjev,1934)、纽带亚科(Hoplolaiminae Filipjev,1934)、螺旋属(HelicotylenchusSteiner,1945)。

表3 葡萄根部双宫螺旋线虫的测量值与文献记述的比较

A.雌虫整体；B.雌虫头部；C. 阴门；D.雌虫尾部；墨线图(a.雌虫头部；b.阴门；c.雌虫尾部)A. Entire view of female; B. Female anterior; C. Vulva; D. Female posterior; Drawings for nematode(A. Female anterior; B. Vulva; C. Female posterior)图3 双宫螺旋线虫[ Helicotylenchus dihytera(Cobb，1893)Sher, 1961]Fig.3 Helicotylenchus dihytera

分布地区：云南省蒙自市文澜落龙庄、草坝营房、六村、十七村。

形态描述(图4)。雌虫：热杀死后虫体呈螺旋形或“6”形，体表环纹明显，侧线4条；头架发达，唇区突出呈半球形，不缢缩；口针发达，基部球明显，略呈杯状，前缘平；背食道腺开口于口针基部球后9～12 μm 处； 中食道球卵圆形；食道腺从腹部覆盖肠；排泄孔位于食道腺的前方，半月体位于排泄口前方邻近；双生殖腺，对伸。尾向腹面弯曲，末端通常为半球状，尾腹端有明显的突起。

雄虫：未见。该线虫的形态特征与测量数据与文献[21]和文献[22]对假强壮螺旋线虫的记述基本相同，故此定名。但该线虫的v值(体前端至阴门的距离)与文献[20]、[21]相比较大。

3 讨 论

本研究对蒙自市葡萄种植区文澜落龙庄、草坝营房、草坝六村、草坝十七村等地的葡萄寄生线虫进行调查和研究，初步鉴定出葡萄寄生线虫3属4种，分别是真滑刃属，燕麦真滑刃线虫；肾形属，肾状肾形线虫；螺旋属，双宫螺旋线虫和假强壮螺旋线虫。其中真滑刃属、肾形属线虫在葡萄上较多，螺旋属线虫分布较广，数量多，是影响葡萄生长的主要病原线虫。有研究表明螺旋线虫的分布寄主及数量最多，为中国葡萄产区的优势种群。其次，螺旋线虫为外寄生，也可内寄生，但不移动，高密度的螺旋线虫会严重危害葡萄根系[21]。

表4 葡萄根部假强壮螺旋线虫的测量值与文献记述的比较

A.雌虫整体；B.头部；C. 阴门；D.雌虫尾部；墨线图(a.雌虫头部；b.阴门；c.雌虫尾部)A. Entire view of female; B. Female anterior; C. Vulva; D. Female posterior; Drawings for nematode(A. Female anterior; B. Vulva; C. Female posterior)图4 假强壮螺旋线虫[ Helicotylenchus pseudorobustus ( Steiner，1914) Golden, 1956]Fig.4 Helicotylenchus pseudorobustus

线虫的形态特征是区别各种线虫和进行分类鉴定的主要依据，本研究中线虫种类鉴定均采用传统的形态学鉴定方法。在测量时有些值与资料报道的数据稍微有些偏差，如：文章中燕麦真滑刃线虫的b值(体长/体前端至食道与肠连接处的距离)与文献相比较小；肾状肾形线虫雄虫的尾长与a值(体长/最大体宽)与文献相比均较小；双宫螺旋线虫的口针基部球宽较文献值大；假强壮螺旋线虫的v值(体前端至阴门的距离)与文献相比较大。造成这种偏差的原因，一方面可能是由于样品固定后线虫虫体有所缩小造成的，另一方面也可能是由于地理区域、生存环境、土壤类型、营养条件、气象因素、气候因素等许多方面的差异造成种内变异。对于这些线虫的生物学特性和以上诸多影响因素中单个因子或综合因子对线虫种群的影响有待进一步的分析和研究[23]。

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(责任编辑 王家银)

Species Identification of Parasitic Nematodes from Grapes Rhizosphere Soil of Mengzi

LIN Li-fei1, PAN Yun-mei1, YANG Li2, LONG Yao-yun3, HU Xian-qi1*

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China; 2.Biology Department of College of Fisheries Life Science for Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China; 3.Key Laboratory for Crop High Quality Cultivation and Security Control of Yunnan Province, Yunnan Honghe University, Yunnan Mengzi 661100, China)

From 2014 October to 2015 February, we surveyed the grapes cultivation area in Mengzi Luo Long Zhuang of Wenlan, Yingfang, Liu Cun, Shi Qi Cun of Caoba. The plant appeared leaf potential weak yellow or brown roots were chosen for sampling, Approximatedly, 2 kg rhizosphere from each plant were collected by five point sampling method. In total, 28 soil samples. By the methods of morphological identification, the species of parasitic nematodes in rhizosphere soil of grapes in the preliminary were identified. 3 genera and 4 species of plant parasitic nematodes were identified,A.avenae(AphelenchusavenaeBastian,1865),R.reniformis(RotylenchulusreniformisLinford et Oliverira, 1940),H.dihytera[HelicotylenchusdihyteraSher Cobb, 1893, 1961],H.pseudorobustus[HelicotylenchuspseudorobustusGolden (Steiner, 1914), 1956].

Vitisviniferal;Parasitic nematodes;Identification

1001-4829(2016)12-2859-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.017

2015-12-22

云南省应用基础研究项目(2009ZC131M);第一批校中青年学术带头人后备人才(2010PY0104);校级项目(XJ1Y0801);红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目

林丽飞(1978-)，女，硕士，副教授,从事植物病虫害的研究,E-mail:llf_biology2@126.com,*为通讯作者，E-mail:xqhoo@126.com。

S663.1

A