短期饲喂黄曲霉毒素B1对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性及基因表达的影响

■ 赵 伟 王宝杰 刘 梅 蒋克勇 齐灿灿 杨 广* 王 雷

（1.天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；2.中国科学院海洋研究所中国科学院实验海洋生物学重点实验室，山东青岛266071；3.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室，山东青岛266071）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）于20世纪80年代末由南美洲引入我国后，现在在各沿海及内陆和盐碱地养殖规模不断扩大，已成为当前我国对虾养殖的最主要品种和我国水产养殖经济的重要支柱产业。随着集约化养殖程度的增加，对配合饲料的需求也在日益增加，使得对虾饲料工业迅猛发展。饲料主要原料有棉籽粕、小麦、花生粕、玉米、豆粕和鱼粉等，这些原料在生产、储存、运输过程中易发生霉变，据报道世界上每年大约有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，造成了巨大的经济损失。

黄曲霉毒素是一类二呋喃香豆素衍生物，被国际癌症研究机构分类为I类致癌物，在温度24～35℃，湿度超过10%时，由黄曲霉、寄生曲霉等在生长过程中产生的次级代谢产物，在热带和亚热带地区水产饲料中普遍检出，带来了巨大的经济损失。饲料和原料中黄曲霉毒素B1（AFB1）污染使畜禽摄食率降低、代谢紊乱、饲料转化效率降低、生产能力下降及肝脏肾脏损伤，造成免疫力下降，提高了机体对疾病的易感性，严重时甚至造成死亡，其次通过食物的直接消费或进食含有AFB1的畜禽产品的间接消费对人类生命健康安全带来威胁。

目前关于AFB1的研究多集中在畜禽动物上，对于水产动物影响的研究也多集中在鱼类。有关饲料中AFB1对凡纳滨对虾的影响机理研究并不多见，尤其是从分子和基因层面的研究。本研究拟在已有AFB1对水产动物影响研究的基础上，测定AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性和免疫相关基因表达的影响，从生理和分子层面去探索AFB1导致凡纳滨对虾肝胰腺病变发生的过程及机制，为预防和消除该类毒素对水产动物的影响提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凡纳滨对虾由青岛瑞滋海珍品发展有限公司提供，随机挑选健康无病，规格均一的凡纳滨对虾[初始体重(2.40±0.13)g]，正式试验开始前将凡纳滨对虾暂养在水族箱中，以对照组饲料饱食投喂，暂养1周后开始试验。

1.2 试验饲料的制备

由于AFB1毒素对水产动物影响的研究多集中在长期低剂量暴露条件下，因此本研究目的是以高浓度的AFB1短时间内对凡纳滨对虾肝胰腺产生的影响。Ostrowaki-Meissner等研究结果显示以15 mg/kg AFB1饲喂凡纳滨对虾2周，造成100%死亡率。因此本试验选取15 mg/kg作为试验浓度，12 d作为试验周期。

在基础配合饲料中添加AFB1标准品（Sigma公司，美国）配制成毒素含量分别为0 mg/kg的对照组和15 mg/kg的试验组饲料。试验组饲料的制备采用以下方法，将AFB1溶解于氯仿后加入鱼油混合均匀，于37℃水浴2 h时，将氯仿蒸发备用。试验组溶解AFB1所需鱼油等量添加于对照组饲料中。两组饲料均置于4℃冰箱保存。基础饲料为烟台大乐饲料有限公司生产的南美白对虾饲料1#料，饲料基础营养组成为粗蛋白42.3%、粗脂肪7.2%、灰分15.5%、水分11.6%。

1.3 饲养管理

对虾在室内规格为80 cm×60 cm×50 cm的试验水箱中饲养12 d，试验用水为砂滤后的天然海水，盐度30。每种饲料设置3个平行组，每组放养对虾50尾。按照对虾体质量的7%投喂饲料。每天分别在8∶00、14∶00、19∶00各投喂1次。每天上午喂料前用虹吸法清除粪便并换水1/3，及时巡查，拣出死虾。每天记录水温、溶解氧和pH值。试验期间水温(28±1)℃，溶氧量≥6 mg/l，pH值8.0±0.2。

1.4 基因表达的测定

分别在第1、4、8 d和12 d取对照组和试验组的凡纳滨对虾样品，每个平行取3只虾，将肝胰腺完整分离后，取米粒大小的组织保存于多管RNA组织样本保存液中，4℃冰箱过夜，然后将样品冷冻于-80℃冰箱保存备用。

RNA提取：按照RNA提取试剂盒（TaKaRa）的说明书进行。

RNA反转：利用TransScript®One-Step gDNA Re⁃moval and cDNA Synthesis Kit试剂盒（全式金生物科技有限公司），按其说明书进行。基因表达测定所用引物如表1所示。

实时定量PCR（qPCR）：参照说明书，利用TransStar Top Green qPCR PCR Super mix试剂盒(全式金生物科技有限公司)进行相关基因表达的测定。用2-ΔΔCT的方法对差异表达基因进行数据处理。

1.5 抗氧化酶活性测定

表1 试验所用引物及序列

分别在第1、4、8 d和12 d时取对虾肝胰腺，每个平行取4只混样，-80℃冰箱保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）活性的测定。酶活性测定按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行。

1.6 统计分析

数据均采用“平均值±标准误”表示。用SPSS 18.0统计软件中的单因素变量方差分析方法（One-Way ANO⁃VA）对数据进行统计学分析。P＜0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 AFB1对凡纳滨对虾存活率的影响

饲料中AFB1对凡纳滨对虾存活率的影响见表2。从表2中可以看出，试验期间，试验组对虾的存活率均显著低于对照组（P＜0.05），第12 d试验结束时对照组对虾的存活率为(97.33±0.02)%，显著高于试验组的(65.50±0.03)%（P＜0.05）。

表2 AFB1对凡纳滨对虾累积存活率的影响(%)

2.2 AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化物酶活性的影响

2.2.1 超氧化物歧化酶（见图1）

由图1可知，试验期间，试验组凡纳滨对虾肝胰腺SOD活性均显著高于对照组（P＜0.05），在第12 d时达到最大值21.50 U/mg。

2.2.2 过氧化物酶（见图2）

由图2可知，试验期间，试验组凡纳滨对虾肝胰腺CAT活性均显著高于对照组（P＜0.05），整体呈现先上升后下降的趋势，在第4 d时达到最大值5.99 U/mg。

图1 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺超氧化物歧化酶活性的影响

图2 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺过氧化物酶活性的影响

2.2.3 谷胱甘肽-S转移酶（见图3）

图3 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺谷胱甘肽-S转移酶活性的影响

由图3可知，试验期间，试验组凡纳滨对虾肝胰腺GST活性均显著高于对照组（P＜0.05），总体呈现上升趋势，在第12 d时达到最大值16.41 U/mg。

2.2.4 谷胱甘肽过氧化物酶（见图4）

由图4可知，试验期间，试验组凡纳滨对虾肝胰腺GSH-Px活性均显著高于对照组（P＜0.05），总体呈现下降趋势，在第1 d时为最大值24.18 U/mg。

图4 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

2.3 AFB1对凡纳滨对虾mTOR信号通路和免疫相关基因表达的影响

2.3.1 凡纳滨对虾肝胰腺中mTOR信号通路相关基因的表达（见图5）

图5 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺中mTOR信号通路相关基因表达的影响

由图5可知，与对照组相比，试验组对虾肝胰腺中4EBP基因在第1、4、8 d和12 d时表达水平均显著上调（P＜0.05），呈现先升高后下降的趋势，其中在第8 d时上调幅度最大，为对照组的35.27倍；P70s6k呈现先升高后下降趋势，其中P70s6k基因在第4 d时上调幅度最大，为对照组的3.33倍，在第8 d和12 d时显著下调（P＜0.05）；eIF4E1A基因在第1 d和4 d时表达水平与对照组相比没有显著性差异，在第12 d时显著下调，仅为对照组的0.32倍；eIF4E2基因在第1 d和4 d时显著上调（P＜0.05），在第1 d时上调幅度最大，为对照组的1.87倍，在第12 d时显著下调，仅为对照组的0.34倍。

图6 饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺中免疫相关基因表达的影响

2.3.2 凡纳滨对虾肝胰腺中免疫相关基因的表达（见图6）

由图6可知，与对照组相比，GST基因在试验组对虾肝胰腺中表达水平均显著上调（P＜0.05），总体呈现先上升后下降的趋势，在第8 d时上调幅度最大，为对照组的9.55倍；ProPO基因表达水平呈现先上升后下降的趋势，在第8 d时上调幅度最大，为对照组的60.51倍；Rab基因表达水平呈现先上升后下降的趋势，在第4 d时上调幅度最大，为对照组的6.37倍，在12 d时显著下调，仅为对照组的0.55倍。

3 讨论

肝脏是黄曲霉毒素B1的靶器官，而肝胰腺又是对虾最主要的消化和免疫器官，对虾肝胰脏的健康程度是养虾成败的关键因素之一。目前，关于AFB1对对虾肝胰腺氧化损伤的研究大都停留在宏观水平，针对AFB1对其氧化损伤及分子机理的研究较为缺乏。因此，研究饲料中AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺损伤作用有着重要的意义。

3.1 AFB1对抗氧化酶活性的影响

呼吸爆发是甲壳动物对抗外来物入侵的一种重要防御策略，它发生迅速而且短暂，能够产生大量的活性氧（ROS）。当AFB1侵入凡纳滨对虾体内时，会激发对虾天然免疫系统，产生大量的ROS以对抗AFB1的侵入，虽然释放ROS是甲壳动物对抗外来物侵入的重要防御机制，但是产生过量会导致细胞损伤，而大多数细胞具有酶促体系，包括SOD、CAT、GST、GSH-Px等都是必不可少的内源性抗氧化防御系统，能够清除ROS和维护细胞氧化还原平衡，阻止或修复氧化损伤。肝胰腺被认为是甲壳动物最主要的免疫器官，是产生清除外来物的免疫防御分子的主要场所，也是ROS产生和释放的中心。Han等研究发现当饲喂含AFB1超过 10 μg/kg时，异育银鲫血清中的SOD显著高于对照组。Zeng等研究结果表明，当饲料中AFB1含量为1 000 μg/kg时，饲喂凡纳滨对虾8周，GST活性显著高于对照组和低浓度组。Manal等研究结果显示，注射了AFB1的罗非鱼，肝胰脏中GSH-Px的活性显著高于对照组，而CAT的活性降低。与上述研究结果相似，本试验结果显示，在短期饲喂15 mg/kg AFB1后，凡纳滨对虾肝胰腺中SOD、GST、GSH-Px、CAT活性均显著高于对照组，且GST基因的表达水平显著上调，表明凡纳滨对虾在摄食含AFB1的饲料后，肝胰腺的抗氧化酶系统被激活，由此来清除过量的ROS和维持细胞氧化还原平衡。有研究发现AFB1会引起机体抗氧化酶活性的降低，可能是因为AFB1对机体造成损害，使机体生成抗氧化酶的能力下降。本研究中没有出现抗氧化酶活性的降低可能是由于试验时间短，AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺的损伤还未达到抑制肝胰腺产生抗氧化酶的程度。

3.2 AFB1对mTOR信号通路的影响

信号转导分子受外界压力影响，可通过诱导细胞凋亡系统或加强防御系统来调控细胞存活或死亡。其中mTOR信号通路在细胞生长过程中处于核心地位，不仅具有调控基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成等多种生物学功能，在细胞的生长、增殖、凋亡中也起到了重要作用。已有研究显示mTOR信号通路与人类疾病相关，mTOR信号通路异常可诱发癌症和糖尿病。而AFB1是一种可诱发肝癌性毒素，因此mTOR信号通路可作为AFB1对肝脏产生损伤的标志性通路。徐昌志研究结果显示，注射25 μg/ml微囊藻毒素，大鼠肝组织中mTOR和s6k磷酸化水平出现下降趋势，表明毒素可引起mTOR信号通路异常，诱发原发性肝癌。Xu等研究显示帕金森病毒素在开始阶段，PC12细胞中s6k表达水平上调，而随后mTOR通路受到抑制，阻碍s6k和4EBP的磷酸化，细胞死亡。本研究结果与上述结果相似，4EBP基因在试验期间的表达水平均显著高于对照组，而P70s6k、eIF4E1A和eIF4E2基因的表达水平随攻毒时间的增加先上升后下降，表明毒素侵入机体后mTOR信号通路调控出现异常。有研究表明机体在低能和氧化压力下，mTOR信号通路调控会受到抑制，因此抑制了细胞的生长和生物合成过程，最终导致细胞死亡。在本研究中，mTOR信号通路异常可能是由于AFB1诱发机体产生过量ROS以对抗其侵入，抗氧化酶活性的升高也证明了ROS的产生，而正是这种氧化压力抑制了mTOR信号通路，最终可能导致细胞凋亡。

3.3 AFB1对免疫相关基因表达的影响

Rab蛋白在细胞生物合成以及胞吞胞吐等囊泡转运的各个环节中起着重要的调控作用。最近有研究发现Rab在细胞吞噬体的形成和成熟中有重要影响，在机体先天免疫中，对清除外来病原菌也起到了重要作用。有研究显示，感染白斑病病毒的凡纳滨对虾48 h，在肝胰腺中Rab基因的表达水平显著高于空白组。而本研究结果显示饲喂AFB1的凡纳滨对虾肝胰腺中Rab基因的表达水平呈现先上升后下降的趋势，与Wang等研究结果一致，其研究显示在各种环境（温度、盐度、细菌、重金属和pH值）胁迫下，凡纳滨对虾肝胰腺中Rab基因的表达水平与对照组相比均有显著变化，随胁迫时间的增加呈现先上升后下降的趋势。表明Rab参与了凡纳滨对虾清除AFB1的免疫反应，吞噬作用在抵御AFB1对虾体的毒害过程中发挥了重要作用。酚氧化酶原系统是甲壳动物最重要的免疫反应体系，其PO活力的强弱与机体的免疫力直接相关，可作为衡量甲壳动物免疫功能大小的指标之一。本研究结果显示，试验组中ProPO的表达量在试验前期显著高于对照组，在第8 d时达到最大值，而在第12 d时下调，与王丹丽等研究结果相似，其研究发现注射了白斑病病毒的凡纳滨对虾肝胰腺中ProPO表达水平在24 h时显著高于空白组，随着感染时间延长ProPO基因表达水平呈显著下降趋势，这表明Pro⁃PO基因在对虾抗毒素的非特异性免疫过程中发挥了作用，可以作为毒素侵染前期的参考指标。

4 结论

与现有研究的长期攻毒试验不同，本研究首次以AFB1对凡纳滨对虾进行短期投喂攻毒试验，探讨了AFB1对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶活性的影响，并首次探究了AFB1对凡纳滨对虾mTOR信号通路相关基因的表达调控。本研究结果表明饲料中黄曲霉毒素（15 mg/kg）对于凡纳滨对虾有显著影响，饲喂12 d就损害其肝胰腺，造成抗氧化酶活性升高，mTOR信号通路受到抑制，死亡率达到了34.5%，在实际生产过程中可能因此造成疾病和大范围死亡。本研究以期能为水产品饲料中AFB1的预防和消除提供科学有效的依据。

（参考文献刊略，需者可函索848334766@qq.com）