高效液相色谱法测定饲料中五种核苷酸的含量

■蔡小明 吴少明 杨旺火 刘 芳 梁 敏 林 钦

（福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002）

核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。根据碱基的不同，又有腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）、鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黄嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）等[1]。随着动物营养学研究深入，核苷酸在饲料中的功能和作用机理也逐步被人们重新认识，在动物生长过程中可提高免疫力，促进铁的吸收，参与脂蛋白的代谢，调节肠道菌群，有助组织生长和分化等[2-3]。

国内对核苷酸检测方法研究较少，特别是饲料中核苷酸检测方法研究未见报道。目前，核苷酸的测定方法主要有：荧光法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、离子交换色谱法及液相色谱-质谱法等[4-6]。毛细管电泳法重现性较差，荧光法及离子交换色谱法存在较大的干扰，饲料基质较为复杂，采用液相色谱-质谱法基质效应强，准确定量较为困难。因此，本文欲选用高效液相色谱建立饲料中五种核苷酸的测定方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器和试剂

Alliance 2695高效液相色谱仪器（配二极管阵列检测器）（美国Waters公司）、Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）、BT 224 S分析天平（德国赛多利斯公司）、DS-8510 DTH超声波振荡器（上海生析超声仪器有限公司）、XH-B旋涡混均器（江苏康健医疗用品有限公司）、0.45 μm尼龙滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

五种核苷酸标准品：腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(尿苷酸，UMP)及次黄嘌呤核苷酸(IMP)购于德国DR公司。试验用水为Milli-Q超纯水，其余试剂均为色谱纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18(5 μm、4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-水溶液（含0.04%磷酸及0.7%三乙胺）；流速1.0 ml/min；柱温：35℃；检测波长（UV）255 nm；进样量10 μl。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 储备液的配制

准确称取五种核苷酸标准品约25 mg（准确至0.000 1 g），超纯水溶解定容至25 ml（每个组分称取的质量都要校正水分和钠盐含量，以酸型计）。配制成浓度约为1.00 mg/ml的标准储备液。

1.3.2 标准工作曲线的配制

准确吸取适量标准储备液，稀释成浓度分别为2、5、10、20、50 μg/ml的标准系列。

1.4 样品处理

准确称取5 g样品于100 ml锥形瓶中，加入40 ml超纯水、0.1 g EDTA超声提取15 min后，0.1 mol/l盐酸调节pH值至3.0，转移至50 ml容量瓶，超纯水定容，充分混匀，离心后过0.45 μm滤膜，供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将五种核苷酸储备液稀释成适量浓度上机测试，在208～384 nm波长进行全扫描，结果如图1所示，五种核苷酸最大吸收峰在245.8～277.8 nm之间，试验结果表明，在255 nm处，五种核苷酸响应均较好，且无明显干扰，因此本文选择255 nm作为五种核苷酸的检测波长。

2.2 流动相的选择

核苷酸类物质通常采用液相色谱检测，其流动相中需加入离子对试剂才能实现基线分离，本试验选用甲醇/水作为流动相，分别加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵、四丁基氯化铵3种离子对试剂，考察其对5种核苷酸分离度的影响，试验数据表明，三乙胺的结果最优。此外，本试验还考察了流动相的pH值对5种核苷酸保留能力的影响，分别在水相中加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%磷酸，结果显示加入0.04%的磷酸时5种核苷酸的保留时间较为理想，基线分离的同时又节约分析时间。

图1 五种核苷酸光谱图

2.3 前处理条件优化

饲料基质较为复杂，其所含的蛋白质、脂肪及重金属离子等均会对检测造成影响。因此，本文采用调节pH值沉淀蛋白、加入EDTA络合重金属离子。分别采用甲酸、0.1 mol/l盐酸、冰乙酸及0.1%三氯乙酸溶液调pH值，结果表明当采用0.1 mol/l盐酸试验，调节pH值至3.0，蛋白沉淀较全，干扰最小，且回收率较优；而EDTA的量太少，金属离子去除不完全，过多则会影响色谱柱的使用寿命，分别采用不同量的EDTA（0.05、0.10、0.15、0.20 g）进行试验，结果显示，当EDTA的量达到0.10 g及以上时，结果较好。因此，本文选用0.1 mol/l盐酸作为酸度调节剂，采用0.10 g EDTA作为络合剂。

2.4 线性范围和检测限

在2.0～50.0 μg/ml范围内配制五个不同浓度水平标准溶液进行试验，以目标物的峰面积作为y轴，浓度作为x轴进行线性回归，得出线性回归方程。检测限以3倍信噪比计，定量限以10倍信噪比计(结果见表1)，5种核苷酸线性关系良好（R2值均大于0.999），检测限在2～4 mg/kg之间，定量限在6～12 mg/kg之间，满足分析要求。

表1 线性方程、线性参数及线性范围

2.5 精密度与准确度

以阴性饲料样品作为基质，进行10、50、200 mg/100 g三种水平加标回收试验，每种水平平行试验6次，结果见表2。由表2可知，5种核苷酸平均回收率在95.1%～109.0%之间，相对标准偏差（RSD）在0.6%～2.8%之间，满足方法学要求。

表2 回收率与精密度（n=6）

2.6 实际样品检测

随机购买市售三种不同类型饲料，每种选取10家不同品牌样品进行5种核苷酸的测定。结果见表3。浓缩料中5种核苷酸均有检出，含量在84～10 589 mg/100 g之间；配合饲料检出4种核苷酸，含量在25～1 938 mg/100 g之间；鱼粉中检出3种核苷酸，含量在2 547～22 401 mg/100 g之间，说明所建立方法适用于饲料中5种核苷酸的检测。

表3 饲料中五种核苷酸含量范围（mg/100 g）

3 结语

本文建立了饲料中五种核苷酸的高效液相色谱的测定方法，该方法操作简单、检测限低、重现性好，并成功将该方法应用于实际样品的检测，为饲料中核苷酸检测提供参考。