液相色谱-质谱联用仪测定蔬菜中6-苄基腺嘌呤的研究

□ 王成梅 张广昊 山东济宁中质华检测试检验有限公司

液相色谱-质谱联用仪测定蔬菜中6-苄基腺嘌呤的研究

□ 王成梅 张广昊 山东济宁中质华检测试检验有限公司

本文建立了蔬菜中6-苄基腺嘌呤的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的定性定量方法。样品经过甲醇水提取后，利用三重串联四级杆液质联用技术进行分析。样品前处理只需要进行简单的分散和C18、ODS固相萃取净化，离心后分析。利用超高效液相色谱进行快速分离，采用MRM模式的电喷雾离子源串联质谱进行定量分析。以0.5%的甲酸和甲醇作为流动相进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min.通过优化得到较好的线性和较低的检出限：线性范围为0.01～10 μg/L，线性相关系数为0.999 5。该方法重现性和回收率很好，回收率为95.26%～107.23%，相对标准偏差为0.82%～2.68%。该方法易用、快速、灵敏度高及结果准确可靠，适用于蔬菜中6-苄基腺嘌呤的分析研究。

高效液相色谱-质谱联用仪；6-苄基腺嘌呤；蔬菜

6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine）是一种植物生长调节剂，属于人工合成的细胞分裂素，具有抑制植物体内叶绿素、核酸、蛋白质分解，保绿防老的作用。目前主要应用于蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育。它虽然在植物体内含量甚微但是却显著影响植物的生长发育，其主要作用是促进细胞的分裂和侧芽的发育以及打破再生芽休眠[1]等。6-BA能提高种子发芽率，促进幼苗生长，最终提高产率，常被用于促进豆芽的生长，提高烟叶的产量等。但是从食品安全的角度考虑，6-苄基腺嘌呤具有一定的毒性[2]。为了保证进出口食品添加剂6-苄氨基腺嘌呤质量和使用安全，维护消费者的利益，建立一种快速准确测定豆芽中6-苄氨基腺嘌呤质量的方法，在生物化学、农业、食品行业和进出口行业中都具有很重要的意义。目前6-苄基腺嘌呤的检测方法主要有分光光度法[3]和高效液相色谱-紫外分析法[4]。对于高效液相色谱-串联质谱（HPLCMS/MS）的测定方法却鲜有报道。本实验建立了HPLC-MS/MS测定蔬菜中6-苄基腺嘌呤的定性和定量方法，该方法易用、快速、灵敏度高、结果准确可靠及成本低，适用于分析蔬菜中6-苄基腺嘌呤的研究。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 6460液相-串联质谱联用仪（美国Agilent公司）配有Agilent 1260高效液相色谱仪以及EI源，Secura513-1CN电子天平（美国赛多利斯），XW-80A涡旋振荡器（上海医大仪器厂），ASE-12固相萃取装置，IKARRV10旋转蒸发仪，IKA T25均质器，北京普析 GWA-UN4-20纯水机，微波萃取仪，SIGMA低温离心机。

1.2 试剂

6-苄基腺嘌呤（纯度＞98%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），C18，ODS。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm×2.1 mm 50mm），进样量：2 μL，流速：0.4 mL/min，柱温：40 ℃，流动相A：0.5%甲酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

表2 6-苄基腺嘌呤质谱分析优化参数

1.3.2 质谱条件

6-苄基腺嘌呤的检测离子对、保留时间、解离电压和碰撞能量见表2。

1.4 样品制备

精确称取完全混匀搅碎的样品5 g（精确至0.001 g）置于50 mL的离心管中，加入4∶1的甲醇水，均质，微波辅助萃取30 min，离心。称取0.2 mg C18和0.15 mg的ODS固相萃取吸附剂，离心后的上清液1 mL置于固相萃取吸附剂的离心管中，涡旋，离心，取上清液过膜上机待测。

图1 Plus-C18柱和EC-C18柱比较

图2 6-苄基腺嘌呤标准曲线

表3 6-苄基腺嘌呤在不同水平下的回收率和相对标准偏差(n=6)

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱条件的优化

分别对Agilent ZORBAX Eclips e Plus-C18柱（1.8 μ m×2.1 m m 50mm）和Agilent Proshell 120 ECC18柱（2.7 μm 4.6 mm 50 mm），两种不同的色谱柱进行对比分析，结果表明Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱在峰型和出峰时间都比较理想，因此本实验选用ZORBAX Eclipse Plus-C18柱。同时为了优化流动相，考察了不同体系的流动相，最终确定用甲酸水和甲醇做流动相进行梯度洗脱时，分析目标物的分离度和灵敏度较高。具体见图1。

2.2 质谱定性定量分析

根据6-苄基腺嘌呤的分子结构特征，本实验选用电喷雾正离子模式对标准品进行全扫描、子离子扫描和多重反应监测，最终确定6-苄基腺嘌呤的母离子、子离子和最优电压以及碰撞能量。

2.3 前处理条件的优化

本实验分别用酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇水和乙腈水作为提取剂，最终确定甲醇水作为提取剂时效率高，而且从实验的角度来说甲醇的毒性明显要小于乙腈。因此，本实验最终确定以甲醇水作为提取剂。同时比较微波萃取和超声提取，最终确定微波萃取作为提取方法。

2.4 线性和回收率的检测

对一定范围内的标准溶液进行检测，研究表明在0.03～10 μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 5。线性方程为y=46 351.351 218x+35 781.794 881（见图2）。样品经前处理后进行分析，得到方法检出限为0.1 μg/kg。通过蔬菜中添加6-苄基腺嘌呤做加标回收和精密度实验。3个质量浓度的加标水平分别为：0.5、1.0、2.0 μg/kg，回收率和精确度见表3。

3 结论

本实验建立了蔬菜中6-苄基腺嘌呤的HPLC-MS/MS的检测方法。该方法简单实用、测定周期短、灵敏度高、回收率好以及选择性强等优点，适用于大量样品的筛选检测，为蔬菜中6-苄基腺嘌呤的提取提供了科学的依据。

[1]张平,郝建军,于洋,等.GA3与6-BA复合剂对黄瓜产量的影响[J].沈阳农业大学大学学报，2003,34(6):415-418.

[2]张莹,鹿毅,杨涛,等.高效液相色谱-串联质谱法测定果蔬中7种植物生长促进剂残留量[J]分析测试学报,2012(4):629-633.

[3]张志斌，张晓斌.凯氏定氮法测定6-苄基氨基嘌呤的含量[J].河南化工,2010(5):56-57.

[4]杨途熙,魏安智,郑元,等.高效液相色谱法同时测定杏仁中8种植物激素[J].分析化学,2007(9):1359-1361.

王成梅 (1984-),女，山东济宁市，硕士。中级工程师。研究方向：食品检测与分析。张广昊（1990-），男，山东济宁人，硕士。研究方向：食品检测与分析。