GeneQuence试剂盒与国家标准法检测食品中沙门菌的比较

□ 聂蓬勃 刘炎艳 莫仁湘 李 凡 康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司

GeneQuence试剂盒与国家标准法检测食品中沙门菌的比较

□ 聂蓬勃 刘炎艳 莫仁湘 李 凡 康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司

本文采用美国Neogen公司生产的沙门检测试剂盒GeneQuence结合DS2全自动酶标免疫分析仪对植物提取物进行沙门菌的检测，与传统检测的国家标准法进行对比。结果表明，该方法进行沙门菌的检测，与传统检测方法所得结果一致性达到99%。且该方法操作较传统方法简便，检测时间比传统方法缩短了2 f。

沙门菌；快速检测；GeneQuence

沙门菌(Salmonella spp.)是一种常见的食源性致病菌，引发人和动物的疾病，出现腹泻，急性肠胃炎等疾病。因此控制食品及其原料中的沙门氏菌尤为重要[1]。目前食品中沙门菌的检测主要采用GB4789.4－2010，该方法需经过五个步骤：①预增菌；②选择性增菌；③选择性平板分离；④生化鉴定；⑤血清学鉴定。该方法工作量大，检测时间长（需4～7天），易受检测人员的专业、经验等多种因素的影响，出现误判。因此，需寻求一种快速、有效、准确、简便的检测技术。

Neogen公司生产的沙门试剂盒GeneQuence是基于DNA分子杂交技术设计的。该法针对沙门菌核糖体RNA设计一段寡核苷酸探针，该探针用于与目标rRNA结合，结合后有显色反应，再经过Dynex设备的光路系统进行读数判定结果[2]。

Dynex DS2®全自动酶标免疫吸附（ELISA）分析仪是一款由电脑控制的微孔板处理系统[3]，本文使用该分析仪配套Neogen®沙门菌检测试剂盒用于沙门菌的快速检测，该方法具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，与国家标准方法进行平行比对，结果显示，该方法与GB方法检测结果一致。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

1.1.1 样品

样品共100批，涵盖康宝莱蕾硕公司大部分类型的产品，测试样品及分类清单如下。

样品类型：绿茶提取物、红茶提取物、玉米须提取物、生姜提取物、瓜拉那果粉、洋葱粉、迷迭香提取物和苹果纤维粉各提取10份的数量；薄荷叶粉、葛根提取物、小茴香粉和人参提取物各提取5份的数量；样品编号分别为1-10、11-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、81-85、86-90、91-95、96-100。

1.1.2 标准菌株

阿伯尼沙门菌（Salmonella abony, NCTC 6017）

1.1.3 试剂与培养基

BPW缓冲蛋白胨水（陆桥）；SC增菌液（陆桥）；TTB增菌液（陆桥）；XLDA平板（BD）；HE平板（陆桥）；BS平板（陆桥）；TSI斜面（陆桥）。

1.2 仪器设备

二级生物安全柜：美国Labconco公司；恒温水浴锅：德国Julabo公司；Dynex系统：美国Dynex公司；恒温培养箱：德国Memmert公司。

1.3 实验方法

1.3.1 国家标准方法（GB 4789.4－2010）

以无菌操作称取25 g(或25 mL)样品，置于225 mL的缓冲蛋白胨水中，于（36±1）℃培养8～18 h。轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mLTTB内，于（42±1）℃培养18～24 h。同时，另取1 mL,转种于10 mL SC内，于36±1℃培养18 h～24 h。分别用接种环取增菌液1 环, 划线接种于一个BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板。于36±1 ℃分别培养18 h～24 h，观察各个平板上菌落生长情况，疑似菌落用API鉴定试剂条进行进一步鉴定[4]。

1.3.2 Dynex方法

第一步：以无菌操作称取25 g(或25 mL)样品，置于225 mL的缓冲蛋白胨水中，于（36±1）℃培养24 h，为待测增菌液。

第二步：按照沙门试剂盒的说明书，分别配制：①裂解试剂：用于目标致病菌的裂解，释放出目标待测物rRNA（核糖体RNA）。②杂交溶液：用于目标的rRNA捕获或结合。③探针溶液：用于与目标rRNA结合与检测。④洗液：用于清洗微孔。⑤底物溶液,用于显色反应（加入微孔后，与溶液3中标记的HRP反应显色）。⑥终止液。

第三步：分别加入100 μL裂解溶液和400 μL待测增菌液至小试管中，混匀后置于（65±2.5）℃水浴中裂解5 min。

第四步：将第二步中配置的溶液和第三步配置的待测样品裂解液放置在Dynex仪器指定的位置上。

第五步：开启软件，按照软件提示进行自检，仪器自检完成后，将自动执行加样，加试剂，孵化，测定等操作，最终自动形成检测报告。

1.3.3 自然样品的检测

对以上共100个自然样品，分别使用国家标准方法和Dynex方法进行检测。

1.3.4 人工污染样品的检测

在经1.3.3步骤检测沙门氏菌为阴性的样品中，选择12个(每种类型样品1个)，在其增菌液中添加阿伯尼沙门氏菌（Salmonella abony, NCTC 6017）标准菌株，加入量为10～100 CFU/mL。分别使用国家标准方法和Dynex方法进行检测。

表1 国家标准方法和Dynex方法检测结果

表2 两种方法对阿伯尼沙门菌的检测结果

2 结果与分析

2.1 自然样品的检测分析

对100批样品中12个品种分别使用国家标准方法和Dynex方法进行检测，结果见表1。

由表1可知，100个样品中，只有72号样品用Dynex检测为阳性，而经国家标准方法确认后，为阴性。因此可得知，用Dynex方法和GB方法对比，一致性可达99%。

2.2 污染样品的检测分析

对12个(每种类型样品1个)添加阿伯尼沙门菌（Salmonella abony, NCTC 6017）标准菌株的污染样品，分别使用国家标准方法和Dynex方法进行检测，结果见表2。试验结果表明，Dynex方法和国家标准方法都能够有效检出经浓度为10～100 CFU/mL阿伯尼沙门氏菌污染的样品。两种方法一致性达100%，且无假阴性结果。

3 结果与讨论

Dynex方法比国家标准方法操作简便，只需要配置一种培养基—缓冲蛋白胨水。而国家标准方法则需要配制很多种培养基。Dynex方法只需30 h左右即可出结果，而国家标准方法至少需要4 d。因此Dynex至少可缩短2 d的检测时间。Dynex方法结果判读由机器完成，而国家标准方法需有经验的人员进行判读。因此Dynex方法可减少由人员造成的误差。通过对112个样品进行检测方法比对，发现两种方法的符合率超过99%，因此可证实用Dynex方法进行沙门氏菌的检测是可靠的。

[1]SG Wilson, S Chan, M Deroo, et al. Development of a Colorimetric, Second Generation Nucleic Acid Hybridization Method for Detection of Salmonella in Foods and a Comparison with Conventional Culture procedure[J].Journal of food science, 1990, 55(5):1394-1398.

[2]袁辰刚，韩伟，谢小钰，等.沙门氏菌快速测试片在食品检测中的初步应用研究[J].食品安全质量检测学报，2015,6(1):293-298.

[3]田银芳,王翌明.ELISA方法与国标法在检测鲜奶中沙门氏菌的比较研究[J].中国乳品工业,1998,26(5):32-33.

[4]文其乙,焦新安,刘秀梵.酶免疫方法快速检测沙门氏菌的研究进展[J].肉品卫生,1995(7):27-29.