黎药经验方的致突变试验研究

周 星 高香奇 符欣蕙

海南省药物研究所，海南 海口 570311

黎药经验方的致突变试验研究

周 星 高香奇 符欣蕙

海南省药物研究所，海南 海口 570311

目的：考察黎药经验方的遗传毒性。方法：致突变试验采用鼠伤寒沙门菌回复突变试验( Ames 试验)、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸型试验等三项试验。Ames 试验：设受试物5个剂量组(即5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿)，另设未处理对照组、溶剂对照组和阳性对照组; 微核试验：小鼠50只，雌雄各半，设10、5.0、2.5 g/kg·bw 剂量组，另设溶剂对照和阳性对照组; 精子畸型率试验：昆明种小鼠雄性25只，分组同微核实验，检测精子畸形率。结果：Ames 试验中，加或不加 S9 的情况下，受试物对TA97、TA98、TA100和TA102菌株均未显示致突变作用。与溶剂对照组比较，高、中、低3个剂量的受试物组雄性、雌性小鼠微核试验、小鼠精子畸变率差异无统计学意义(P>0.05)。结论：综合考虑前期试验结果及相关研究，在本次实验条件下，在一定剂量范围内，Ames 试验、 微核试验和小鼠精子畸变试验结果显示阴性，认为该黎药经验方具有遗传毒性的可能性较小。

验方；黎族；致突变；遗传毒性

本黎药验方中所含的主要有鸡血藤、补血藤、七叶莲、牛大力等药材。该方为黎族民间的经验方，在黎医指导下，用于调节妇女产后身体状态并可促使其恢复体力。通过动物实验发现该方能显著延缓小鼠游泳至力竭的时间，发现其具有较强的延缓疲劳的作用，能有效提高运动耐力，具有抗疲劳功效[1]。其中主要药材鸡血藤、牛大力等在南方民间食疗疗中具有历史悠久。对牛大力的本草考证上发现其始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》(1990年版)收载的地方药材[2]，补腰肾、强筋骨功效显著[3]。鸡血藤是一味活血化瘀中药，能补血、活血、通络；主治月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪等[4]，药理实验研究表明有显著的补血作用[5]。近年来，黎族验方中常见药材鸡蛋花通过高内涵体外微核实验和Ames实验发现还具有较强的抗突变活性[6]。但民族药物来源复杂，部分药材还未收入地方药材标准，故对其开展相关毒理学研究具有重要意义。本研究按黎医采用传统煎煮工艺得到的汤剂作为受试物，以小鼠为实验动物观察该药的致突变作用，旨在为黎族验方的使用安全性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物和试验菌株 黎药验方受试物(以下简称“受试物”，药材由五指山黎族民间医药研究协会提供，按其提供方法得水煎液并浓缩到一定浓度)；Ames试验用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102菌株(海南省药物研究所保存)。

1.1.2 实验动物 无特定病原体(SPF)级KM小鼠50只(25～30g，雌、雄各半)、性成熟雄性KM小鼠25只(30～35g)[海南省药物研究所提供，生产许可证号:SCXK(琼)2015-0007]。动物于屏障系统动物实验室饲养[使用许可证号SYXK(琼)2014-0025]，温度为(24.0±1.5)℃，湿度为(60±10)%，工作照度为200l～300lx，人工照明、黑夜12h交替，噪音<60dB，检疫3d后进行实验。饲养环境和饲料标准均遵循国家相关标准[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验) 采用平板渗入法对样品进行测试，分别在加与不加大鼠肝S9系统的条件下进行试验。鼠伤寒沙门菌突变菌株TA97、TA98、TA100和TA102经鉴定符合要求。设5个剂量:5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿，使用蒸馏水稀释。同时设未处理对照组、溶剂对照和阳性对照组。在顶层培养基中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL试验用受试物溶液和0.5mL肝脏混合功能氧化酶(S9混合液)，混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量6个平皿；(37±1)℃培养48h，计数每皿回变菌落数[9]。

1.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验 体重25～30gKM小鼠50只，随机分为5个组，每组10只，雌雄各半，以受试物对小鼠的急性经口毒性试验最大给药量结果(10g/kg，以流浸膏计)为依据，试验设受试物3个剂量组(即10、5.0、2.5g/kg·bw)、阳性对照组(灌胃40mg/kg环磷酰胺)、溶剂对照组(灭菌水)，间隔24h，2次灌胃，给药体积为0.2mL/10g，末次给予受试物6h后，取胸骨骨髓制片，每只动物观察1000个嗜多染红细胞(PCE)，计数含带微核的细胞数，计算微核率(‰)。同时计数200个细胞中嗜多染红细胞和正染红细胞(NCE)比例[10]。

1.2.3 小鼠精子畸形试验 体重30～35g雄性KM小鼠25只，随机分为5个组，每组5只，分别为受试物3个剂量组(即10、5.0、2.5g/kg·bw)、阳性对照组(灌胃40mg/kg环磷酰胺)、溶剂对照组(蒸馏水)，每日灌胃1次，连续5d，末次灌胃30d后处死小鼠，取附睾制片，每只动物观察计数1000个结构完整的精子，计数畸形精子数，计算精子畸形率(%)[11]。

2 结果

2.1 受试物致突变作用 各菌株不同阳性对照回复突变菌落数均远超溶剂对照和未处理对照突变菌落数，表明试验体系可靠。在检测剂量范围内，加或者不加S9的情况下，受试物对4个菌株均未显示诱变作用。见表1。

表1 Ames试验结果 ，个)

注：1:2-氨基芴0.010mg/皿;2:1,8-二羟蒽醌0.050mg/皿;3:敌克松0.050mg/皿;4:叠氮钠0.0015mg/皿;+S9:加肝脏混合功能氧化酶;-S9:不加肝脏混合功能氧化酶。

2.2 受试物对小鼠骨髓PCE微核率影响 与溶剂对照组比较，各剂量受试物组小鼠骨髓PCE微核细胞率差异无统计学意义(P>0.05)；与溶剂对照组比较，阳性对照组小鼠骨髓PCE微核细胞率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；各组小鼠PCE/NCE比值差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 小鼠骨髓微核试验结果 ±s)

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05。

2.3 受试物对小鼠精子畸形率影响 溶剂对照组、受试物3个剂量组(即10、5、2.5g/kg)、阳性对照组小鼠精子畸形率分别为(0.95±0.35)%、(1.02±0.38)%、(1.19±0.27)%、(1.11±0.48)%、(2.96±0.97)%；与溶剂对照组比较，阳性对照组小鼠精子畸形率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，受试物各剂量组小鼠精子畸型率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

Ames试验、小鼠精子畸形试验和小鼠骨髓微核试验作为遗传毒性检测试验常用经典组合。Ames试验检测终点为基因突变，是由美国生化学家BruceN.Ames在1975年建立的鼠伤寒沙门菌回复突变试验，是一种已被公认并广泛开展的致突变鉴定方法。此方法能够在短期内检测药物、食品、化学品、医疗器械等受试物有无致突变性。小鼠精子畸形试验检查受试物能否对破坏哺乳动物精子正常形态。体内微核试验能够检测断裂剂和部分非整倍体诱变剂。

有些中草药具有延缓并消除疲劳、改善激素分泌、提高免疫能力等多种作用，又与运动关系密切。所以，开发中草药运动补剂对提高运动能力、对改善人体功能有重要意义。前期已有研究表明该黎族验方具有抗疲劳作用的效果，且该方在海南黎族地区应用较多，故进行遗传毒性的相关考察具有重要意义。

研究结果表明，与溶剂对照组比较，受试物各剂量组小鼠骨髓微核细胞率和精子畸型率均无明显变化，提示其对小鼠体细胞和生殖细胞均无诱变作用。Ames试验结果显示，受试物各剂量组受试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102)在加S9与不加S9时回变菌落数均未超过未处理对照菌落数的2倍，提示该受试物无间接和直接的致突变作用。

综上所述，在一定剂量范围内，该黎药验方无致突变和致畸作用。感谢五指山黎族民间医药研究协会及杨丽娜女士提供该黎族验方。考虑到本研究所用动物种类局限性，还应扩大实验动物种属，增加其他实验项目进一步探讨其遗传毒性，以确保人体服用的安全性。

[1]张燕，张洪斌.复体力汤对运动小鼠抗疲劳的实验研究 [J].华西药学杂志，2010，25(5)：557-558.

[2]时群，韦大器，陈丽文，等. 牛大力茎段组织培养污染率控制方法的初步研究[J].广西中医学院学报，2007，10(3):63 -65.

[3]黎瑞汝，陈占科，高 珊，等. 中药牛大力的研究进展 [J].亚太传统医药，2010，6(12)：164-166.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010.

[5]符影，程悦，陈建萍，等. 鸡血藤化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2011，42(6)：1229-1233.

[6]张浩，申玉清.鸡血藤醇提物对血虚模型小鼠的补血作用 [J].中国药房，2014，25(3)：221-223.

[7]GB 14925-2010．实验动物环境及设施[S]．北京:中国标准出版社，2010.

[8]GB 14924-2010．实验动物配合饲料卫生标准[S]．北京：中国标准出版社，2010.

[9]李庆，黄俊明，陈美芬，等. 鸡蛋花提取物的抗突变活性研究 [J].广东药学院学报，2015，31(3)：354-358.

[10]范文今，谢韬，牛璐，等. 水飞蓟籽油致突变和致畸作用的研究 [J]. 中国卫生检验杂志，2015，25(15)：2477-2479.

[11]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[Z]．2003-05-01．

(编辑：陶希睿)

Research on mutagenesis caused by proved recipe of the Li

ZHOU Xing GAO Xiangqi FU Xinhui

Phamarceutical institute of Hainan,Haikou 570311, China

Objective To study the mutagenesis caused by sproved recipe of the Li．Methods Ames test Test substance groups of 5.000 mg /dish，1.000，0.200，0.040 mg /dish and 0.008 mg /dish and three control groups(untreated，solvent and positive control) to detect the rechanged bacterium colonies．Micronucleus test 50 samples of the Kunming mice were randomly divided into positive control group，solvent control group and group of test substance 10.0g/kg，5.0g/kg，and 2.5g/kg.There were 10 in each group(male and female in half)．The micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocyte were detected; Sperm malformation rate test 25 samples of the Kunming male mice, designed the groups as micronucleus test, were testing the rate of sperm abnormality．Results Comparing with control group，bone marrow cell micronucleus rate and sperm malformation rate of high，middle and low test substance groups of mice，what had no statistical significance(P>0.05). Compared with the untreated group，different doses of test substance Ames strains from the back variables did not change significantly (P>0.05). Conclusion Considering the preliminary test results and related research, under the conditions of this experiment and in the definite dose range，the three test results above show negative results. There is little possibility that test substance of proved recipe from the Li has mutagenesis.

Proved Recipe;The Li;Mutagenesis; Genetic Toxicity

2016-10-14

周星(1981-)，男，助理研究员，主要从事药学研究。E-mail: zhouxing54@tom.com

R29

A

1007-8517(2016)24-0043-03