草莓茎尖快速繁殖体系的研究

张春芬，潘天任，邓舒，肖蓉，聂元军，李倩，苏东涛，曹秋芬，，孟玉平

（1.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院，山西太原030031；3.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030006；4.山西大学生物工程学院，山西太原030006；5.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

草莓茎尖快速繁殖体系的研究

张春芬1，潘天任2，邓舒1，肖蓉1，聂元军3，李倩4，苏东涛3，曹秋芬1，5，孟玉平5

（1.山西省农业科学院果树研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院，山西太原030031；3.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西太原030006；4.山西大学生物工程学院，山西太原030006；5.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

以“红颜”草莓匍匐茎茎尖为外植体，研究了不同次氯酸钠质量分数及处理时间、不同浓度激素配比对茎尖增殖、组培苗生根的影响，以筛选出外植体最适的消毒处理和最适合的培养基。结果表明，草莓“红颜”匍匐茎茎尖消毒以2%次氯酸钠处理10～15 min为宜；不定芽增殖以1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA组合与0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA较佳；适宜生根的培养基为1/2 MS＋0.1～0.3 mg/LIBA。

草莓；茎尖；快速繁殖

草莓（Fragaia ananassa Duchesne）属蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物，是世界上广泛栽培的重要经济作物。其色泽鲜艳，多汁，酸甜可口，芳香宜人，有“水果皇后”之美誉[1]。加之适应性广，栽培容易，生产周期短，见效快，经济效益高，特别是温室保护地栽培技术的快速发展，可以使之提前或延迟上市，实现周年生产和供应，加速了草莓生产面积的迅速扩大[2]。为确保生产出高品质的草莓果实，必需提供大量的优质草莓种苗。传统生产过程中，草莓主要通过匍匐茎分株繁殖提供种苗，而匍匐茎分株繁殖苗繁殖系数低，苗质量差，且易感染病毒，影响种苗的品质及其经济价值，成为阻碍草莓生产的主要问题[3]。通过组织培养快速繁殖技术获得大量脱毒苗是解决这一问题的有效途径[4]。

本研究利用草莓“红颜”茎尖作为外植体，通过研究外植体的消毒时间、不同激素配比对草莓茎尖增殖及生根的影响，筛选出有利于草莓组培繁殖的最佳处理，以建立简易高效的草莓快繁技术体系，为实现脱毒苗工厂化、规模化生产，快速培育优良的草莓种苗提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

以草莓栽培品种“红颜”的匍匐茎茎尖为试验材料，采自阳曲县浦丰农林科技有限公司试验基地。

1.2 方法

试验在山西省农业科学院生物技术研究中心研究室进行。

1.2.1 外植体消毒连续晴天的下午，自田间选取健壮母株上生长充实、顶端悬空而小叶未展开的匍匐茎，带回实验室，剪取顶端约5 cm长的顶芽，用纱布包好置于自来水下冲洗1 h，在超净工作台内用75%酒精浸泡30 s后，用灭菌蒸馏水冲洗2～3遍，转入2%～5%次氯酸钠中，不断摇动烧杯，使次氯酸钠溶液与茎尖充分接触，经不同时间消毒后，再用无菌水冲洗4～5遍，用无菌吸水纸吸干表面水分，在解剖镜下切取约2 mm的茎尖生长点，接种于初代培养基上。

试验设次氯酸钠质量分数为2%，5%共2个水平，消毒时间为5，10，15 min共3个水平，总共6个处理。每瓶接种一个茎尖，每个处理接种20瓶，重复3次。污染率、褐化率在接种后10 d统计，萌发率在接种30 d后进行统计。

污染率＝污染芽数/接种芽数×100%；褐化率＝褐化芽数/接种芽数×100%；萌发率＝萌发芽数/接种芽数×100%。

1.2.2 继代增殖初代接种成活21～28 d后，将萌发芽转入增殖培养基中，增殖培养基为添加不同浓度的6-BA与IBA的MS培养基。

试验设细胞分裂素6-BA质量浓度为0，0.3，0.5，0.8，1.0 mg/L共5个水平，生长素IBA质量浓度为0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4个水平，共为14个组合。每瓶接3株，每处理10瓶，重复3次，30 d后调查增殖情况。增殖系数＝总增殖芽个数/总接种芽个数。

1.2.3 生根培养待继代植株长到一定大小时，自健壮苗上切取具三叶一心的不定芽接种于生根培养基上，生根培养基为1/2MS添加不同浓度的IBA。

试验设置生长素IBA质量浓度为0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4个处理。每瓶接3株，每处理10瓶，重复3次，25 d后调查生根情况。平均生根条数＝总不定根数/生根芽数。

1.2.4 炼苗与移栽生根培养21～28 d后植株长出3～5条1～3 cm的不定根后，将培养瓶移至温室炼苗，温度为25℃左右，2～3 d后瓶内小苗叶色深绿、表面有蜡质层出现时打开瓶盖，继续炼苗3～5 d后从瓶内取出植株，洗去根部附着的培养基，然后浸入50%多菌灵可湿性粉剂500倍液5～10 min，冲洗晾干后定植于蛭石作基质的营养钵内并浇透水，保湿培养7 d观察其存活情况。

1.2.5 培养条件培养基如无特别说明，均添加3%蔗糖、6.5 g/L琼脂，pH值为5.8，培养基121℃灭菌20 min，自然冷却后备用。培养条件为：温度（25±2）℃，14 h光照，光照强度3 000 lx。

2 结果与分析

2.1 不同处理时间对“红颜”匍匐茎茎尖消毒效果的影响

由表1可知，次氯酸钠质量分数为2%和5%时，污染率随着处理时间的增加而降低，而褐化率与之相反，随着处理时间的增加而升高；污染率在2%次氯酸钠处理5 min时最高，达71.7%，在5%次氯酸钠处理15 min时最低，降至23.3%，褐化率则在2%次氯酸钠处理5 min时最低，为3.3%，在5%次氯酸钠处理15 min时最高，达到48.3%。Duncan方差分析显示，污染率在2%次氯酸钠处理5 min与其他5个处理间存在显著差异，2%次氯酸钠处理10，15 min和5%次氯酸钠处理10，15 min间不存在显著差异，5%次氯酸钠处理5 min与处理10，15 min间都存在显著差异。褐化率在2%次氯酸钠处理5，10 min之间不存在差异，与其他4个处理间差异显著，5%次氯酸钠处理10，15 min的褐化率与其他4个处理间都存在显著差异。接种30 d后的萌发率表现为在2%次氯酸钠处理10 min时最高，为48.3%，其次为2%次氯酸钠处理15 min时的46.7%，这二者之间不存在差异，但都与2%次氯酸钠处理5 min（25.0%）和5%次氯酸钠处理15 min（28.3%）存在显著差异。综合污染率、褐化率及萌发率，草莓“红颜”匍匐茎茎尖消毒以2%次氯酸钠处理10～15 min为适宜时间。

表1 不同处理时间对“红颜”匍匐茎茎尖消毒效果的影响

2.2 外源激素对“红颜”继代增殖的影响

将长势一致的无菌苗分组接种到添加不同质量浓度的6-BA与IBA的增殖培养基中，培养30 d后统计各激素组合的不定芽增殖情况。从表2可以看出，草莓在无添加激素的培养基上也能增殖，但是增殖系数小，不能满足试验及工厂化生产的需要。在添加1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA的培养基上，“红颜”草莓的增殖系数最大，但苗生长过快，容易形成畸形苗，且玻璃化严重；其次依次为组合1.0 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA，0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/LIBA，0.8 mg/L6-BA＋0.1 mg/LIBA，增殖系数分别为8.54，8.39，8.08，各组合间不存在显著差异，但是只在添加0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA的培养基上植株长势健壮，其他组合则多畸形苗，容易玻璃化。在设定的各激素组合中，以0.8mg/L6-BA＋0.3 mg/L IBA组合与0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA组合较佳，苗生长健壮，增殖系数分别为8.39和7.74，二者之间不存在差异。

表2 外源激素对“红颜”继代增殖的影响

2.3 IBA质量浓度对“红颜”组培苗生根的影响

由表3可知，“红颜”草莓的组织培养无菌苗极易生根，在不添加任何激素的1/2 MS中也能生根，但平均生根仅有2.1条，根系较短，且纤细。添加一定质量浓度的IBA能促进不定根的形成，在添加0.5 mg/L IBA培养基中虽平均生根条数最多（6.8），与其他处理都存在显著差异，但有愈伤组织形成，且根系纤细，移栽不易成活。在添加0.1，0.3 mg/L IBA时根系较长，且粗壮，有利于再生苗移栽成活。

表3 不同培养基对草莓生根的影响

3 讨论与结论

在植物的离体培养中，无菌外植体的获得是试验研究顺利进行的关键步骤[5]。从自然界采集的植物器官和组织材料表面携带有各种微生物，因此，在接种前，对植物材料进行表面消毒是植物组织培养的首要工作。目前，有多种化学试剂作为消毒剂可用于植物组织培养外植体消毒，如2%～5%次氯酸钠、0.1%升汞、10%过氧化氢等，这些试剂都对植物组织的表面消毒有良好的效果[6-7]。升汞是草莓常用的外植体表面消毒剂，但由于其是有剧毒的重金属盐消毒剂，残留大，对环境和外植体材料都有很大毒害，因此，本研究选用无毒害作用且残留少的次氯酸钠作为消毒剂，次氯酸钠浓度大小与处理时间的长短不仅影响外植体的消毒效果，还影响着外植体的萌芽率。本研究中，草莓最佳处理为2%次氯酸钠处理10～15 min，处理时间过短会增加污染率，增大工作量；而次氯酸钠浓度过高虽能降低污染率但容易使外植体褐化，影响生长甚至导致死亡。

外源激素是植物组织培养基中不可缺少的关键物质，其浓度和比例会影响器官的分化，对植物离体器官的生长和分化起到非常重要的作用。草莓组培苗的增殖扩繁过程中，适当浓度的激素组合是获得高质量、高增殖系数一个关键因素，激素浓度过高或过低都会影响不定芽的增殖及生长效果。饶雪梅[8]研究了IBA质量浓度对草莓组培增殖的影响，结果表明，增殖系数随IBA质量浓度增大而变大，但是在较高质量浓度时，玻璃化比较严重。本研究也证实，较高质量浓度IBA不利于不定芽的增殖，反而增加了愈伤组织的分化。本研究结果表明，IBA质量浓度低于0.5 mg/L时，增殖系数随6-BA质量浓度的提高而增大，但是6-BA质量浓度达到1.0mg/L时，不定芽畸形或玻璃化严重，这与袁倩等[9]的研究结论一致，使用较高质量浓度的6-BA进行草莓增殖培养增殖系数增大，但是易出现玻璃化[10]。本研究还发现，在6-BA质量浓度为0.8 mg/L时与0.3 mg/L IBA组合优于其他3个组合，但是与0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA组合之间不存在显著差异，说明在草莓培养中改变其中一个激素的质量浓度时，适当改变另一激素的质量浓度同样能达到相同的效果。由此可见，在一定的质量浓度范围内，激素比例是影响草莓增殖分化的重要因素。

组培苗不定根的再生直接影响植物组培快繁工作的成本、工作效率和经济效益。与植物茎尖及其他幼嫩组织相比，根系对激素浓度的变化相对比较敏感，因此，诱导生根所需的激素水平较低。草莓生根常用激素有IAA，IBA，NAA。本试验发现，不添加激素时也能诱导不定芽生根，但是根系纤细，且发根量少，添加一定浓度的IBA促进了不定根的形成，浓度增加到0.5 mg/L时，反而会增加愈伤组织的形成，造成根系纤细，不利于移栽成活。崔广荣等[11]试验发现，没有添加任何激素的对照效果最好，这可能是由于内源激素已能满足植株生根的需要或IBA不利于此基因型草莓诱导生根，因此，在进行草莓生根培养时，要根据试验情况，慎重选择。此外，不少研究者发现，不同品种间对激素的浓度需求存在一定的差异，薛其勤等[12]在对丰香、章姬、甜查理、红颜、卡姆罗莎5个品种的试验中发现，与其他品种相比，丰香极易生根，在增殖培养基中也会有少量根系产生。

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Study on Rapid Propagation ofFragaia ananassaDuchesne Stem Tip

ZHANGChun-fen1，PANTian-ren2，DENGShu1，XIAORong1，NIE Yuan-jun3，LI Qian4，SUDong-tao3，CAOQiu-fen1，5，MENGYu-ping5
（1.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofAgricultural Resources and Economy，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030006，China；4.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；5.Research Center ofBiotechnology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To select the most suitable sterilization time and the most suitable medium,the effects of different disinfection time, different hormone combinations were studied in tissue culttre ofstrawberrytakingthe stemtip as explant material.The results showed that the best sterilization time by 2%NaClO was 10-15 min,the best generation media was 1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA or 0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA.The most suitable rootingmediumwas 1/2 MS＋0.1-0.3 mg/LIBA.

strawberry;stemtip;rapid propagation

S668.4

A

1002-2481（2016）03-0291-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.04

2015-10-09

山西省农业科学院科技自主创新能力提升工程项目（2015zzcx-22）；山西省农业科学院果树研究所项目

张春芬（1981-），女，山西翼城人，助理研究员，博士，主要从事园艺植物生物技术研究工作。