去水卫矛醇对人脑胶质瘤细胞BT325增殖、凋亡及线粒体膜电位的影响

蒋霞，黄银妹，王小洁，刘华钢

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2广西医科大学；3广西壮族自治区食品药品监督管理局)

·论著·

去水卫矛醇对人脑胶质瘤细胞BT325增殖、凋亡及线粒体膜电位的影响

蒋霞1，黄银妹2，王小洁2，刘华钢3

(1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2广西医科大学；3广西壮族自治区食品药品监督管理局)

目的 观察去水卫矛醇( DAG)对人脑胶质瘤BT325细胞增殖、凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。方法 将BT325细胞分为对照组、不同浓度DAG组，作相应处理后培养，测算细胞存活率、单细胞克隆形成率、细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果 随DAG浓度的增加，BT325细胞的存活率逐渐下降(P<0.05)，不同浓度DAG组随培养时间的延长BT325细胞的存活率逐渐下降(P均<0.05)；培养24、48、72 h时，DAG对BT325细胞的IC50分别为108.81、26.61、11.38 μg/mL。不同浓度DAG组BT325细胞克隆形成率均为0，与对照组的16.78%±1.50%相比，P均<0.01。5、10、20、40、80 μg/mL的DAG组BT325细胞凋亡率分别为11.79%±2.91%、15.42%±3.06%、38.70%±1.12%、60.78%±1.30%、80.35%±3.22%，对照组为4.27%±1.72%；不同浓度DAG组BT325细胞凋亡率与对照组相比，P均<0.01，且呈浓度依赖性(P均<0.01)。5、10、20、40 μg/mL的DAG组BT325细胞线粒体膜电位分别为0.174±0.038、0.142±0.037、0.138±0.033、0.119±0.013，对照组为0.193±0.014；20 μg/mL的DAG组与对照组相比，P<0.05；40 μg/mL的DAG组与对照组相比，P<0.01。结论 DAG抑制BT325细胞增殖，诱导细胞凋亡，作用呈浓度依赖性，其机制可能与降低细胞线粒体膜电位有关。

去水卫矛醇；人脑胶质瘤BT325；细胞增殖；细胞凋亡；线粒体膜电位

脑胶质瘤发病率位居脑肿瘤首位，占40%左右[1]。该病具有发病率、病死率、复发率高及治愈率低的特点。去水卫矛醇(DAG)是一种新型己糖醇类抗肿瘤药物，分子量小，体内分布广泛，较易透过血脑屏障，能在脑肿瘤组织中累积，其作为一种抗脑肿瘤和脑转移瘤的新药，目前已受到广泛关注。2015年5月～2016年6月，我们观察了不同浓度DAG对人脑胶质瘤细胞BT325增殖、凋亡及线粒体膜电位的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品、试剂及仪器 人脑胶质瘤细胞BT325。DAG。RPMI-DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰酶消化液，CCK-8，Hoechst 33342，二甲基亚砜。CO2培养箱，连续光谱扫描式酶标仪，荧光倒置显微镜，激光共聚焦扫描显微镜。

1.2 BT325细胞的培养 将BT325细胞置含10%胎牛血清的RPMI-DMEM完全培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液。

1.3 DAG对BT325细胞增殖的影响观察

1.3.1 DAG对BT325细胞存活率的影响观察 采用CCK-8法。取对数生长期的BT325细胞，调整细胞密度为5×104/mL，按每孔100 μL将细胞接种于96孔板。将96孔板置37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h。细胞贴壁后，分为对照组和不同浓度DAG组。对照组不加DAG，不同浓度DAG组分别加入含5、10、20、40、80 μg/mL的DAG培养基100 μL，置37 ℃、5%CO2孵箱中培养，分别于24、48、72 h时每孔加入CCK-8试剂10 μL，震荡混匀。另设空白组，不加细胞，只加100 μL的RPMI-DMEM培养基，处理方法同上。将96孔板放回孵箱中避光孵育1～2 h。酶联免疫检测仪于450 nm波长处测定光密度值(OD值)。计算各组细胞存活率及DAG的IC50，实验重复3次。细胞存活率=(DAG组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.3.2 DAG对BT325细胞克隆形成率的影响观察 取对数生长期的BT325细胞，0.25%胰酶消化，将细胞悬浮在含10%胎牛血清的RPMI-DMEM培养基中，制成单细胞悬液。将单细胞悬液进行梯度倍数稀释，调整细胞密度为300/mL，按每孔1 mL接种于6孔培养皿，将其分为对照组和不同浓度DAG组。对照组加入完全培养基1 mL，不同浓度DAG组分别加入含0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的DAG培养基1 mL。将培养皿置37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h。次日，弃旧培养基，每孔加入RPMI-DMEM培养基5 mL，重新置37 ℃、5% CO2孵箱中，连续培养7 d。终止培养，弃上清液，用PBS清洗2次，加入甲醇固定15 min。弃固定液，加入0.5%结晶紫染色10～30 min，然后用纯水缓慢洗去结晶紫，于显微镜下观察。对大于50个细胞的集落进行统计，计算克隆形成率。实验重复3次。BT325细胞克隆形成率=(集落数/接种细胞数)×100%。

1.4 DAG对BT325细胞凋亡的影响观察 采用Hoechst 33342染色法。取对数生长期的BT325细胞，以5×104/mL的密度种于6孔板，24 h细胞完全贴壁后分为对照组和不同浓度DAG组。DAG组分别加入5、10、20、40、80 μg/mL的DAG。各组培养24 h后各加入10 μL的Hoechst33342染色5 min，PBS洗2遍，置荧光显微镜下观察并拍照。每组3张不同的玻片上各随机选取4个视野计数细胞总数和凋亡细胞数。BT325细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.5 DAG对BT325细胞线粒体膜电位的影响观察 取对数生长期的BT325细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105/mL，按2 mL/孔将细胞加入到3.5 cm2激光共聚焦显微镜专用培养皿。细胞贴壁后分为对照组和不同浓度DAG组。DAG组分别加入5、10、20、40 μg/mL的DAG。各组培养12 h时弃培养基，PBS清洗细胞3次，加入含Rhodamine 123(5 μmol/L)的PBS，于37 ℃、5%CO2孵箱中避光培养30 min，弃上清，PBS洗涤2次，激光共聚焦扫描显微镜观察，分别采用白光、488 nm激光、530 nm激光三通道中速扫描细胞，采集图片。图片荧光强度用Image pro plus 6.0软件分析，首先将荧光照片进行反相处理，用指数光密度曲线进行校正，检测定量区域大小(Area值)和荧光强度值(IOD值)。BT325细胞平均荧光强度值(=IOD值/Area值)即代表线粒体膜电位。

2 结果

2.1 不同浓度DAG组的BT325细胞存活率比较 各时间点不同浓度DAG组的BT325细胞存活率见表1。表1显示，随DAG浓度的增加，BT325细胞的存活率逐渐下降(P均<0.05)；不同浓度DAG组，随培养时间的延长BT325细胞的存活率逐渐下降(P均<0.05)。培养24、48、72 h时，DAG对BT325细胞的IC50分别为108.81、26.61、11.38 μg/mL。

表1 各时间点不同浓度DAG组的BT325细胞 存活率

2.2 不同浓度DAG组与对照组BT325细胞的克隆形成率比较 不同浓度DAG组均无细胞数大于50个的集落形成，克隆形成率均为0；对照组细胞数大于50个的集落有(50.33±4.51)个，克隆形成率为16.78%±1.50%；不同浓度DAG组克隆形成率与对照组相比，P均<0.01。

2.3 不同浓度DAG组与对照组BT325细胞凋亡率比较 5、10、20、40、80 μg/mL的DAG组BT325细胞凋亡率分别为11.79%±2.91%、15.42%±3.06%、38.70%±1.12%、60.78%±1.30%、80.35%±3.22%，对照组为4.27%±1.72%；不同浓度DAG组BT325细胞凋亡率与对照组相比，P均<0.01，且呈浓度依赖性(P<0.01)。

2.4 不同浓度DAG组与对照组BT325细胞线粒体膜电位比较 5、10、20、40 μg/mL的DAG组BT325细胞线粒体膜电位分别为0.174±0.038、0.142±0.037、0.138±0.033、0.119±0.013，对照组为0.193±0.014；20 μg/mL的DAG组与对照组相比，P<0.05；40 μg/mL的DAG组与对照组相比，P<0.01。

3 讨论

细胞无限增殖和凋亡抑制是脑胶质瘤发生、发展的根本原因[2]，凋亡则是成功治疗脑胶质瘤的关键[3]。DAG是一种细胞毒素DNA烷化药，其对慢性粒细胞白血病有较好的近期疗效，对肺癌、原发性脑瘤等亦具有一定治疗效果[4]。体外实验[5]发现，DAG能有效抑制P388和L1210白血病细胞、B16黑色素瘤细胞、CD8F1乳腺肿瘤细胞、Lewis肺癌细胞，尤其能有效抑制脑肿瘤细胞株。张慧玲等[6]研究发现，经不同浓度DAG作用72 h后，SGC-7901、CNE、BEL-7404、H460四种肿瘤细胞的OD值与对照组相比均呈下降趋势，且呈浓度-效应关系。我们的前期研究发现，DAG对IMR-32、SH-SY5Y、U87、A172、T98G、SHG-44、U373、C6、SK-N-BE、BT325、U251等11株人脑肿瘤细胞均具有时间-剂量依赖性的抑制生长效应，DAG的IC50分别为24.28、19.24、21.55、25.13、20.63、21.03、24.91、23.52、22.06、22.92、23.44 μg/mL[7]。本研究结果表明，DAG在体外具有抑制BT325增殖、诱导BT325凋亡的作用。

活性氧(ROS)在启动和调节细胞凋亡中扮演着重要角色[8]。ROS积累过多会导致细胞线粒体膨大，线粒体内膜的非特异性孔道打开，细胞色素C从内膜脱落并进入到胞质，引起胞内促凋亡细胞因子的表达和酶的活化，诱导细胞凋亡。阻止线粒体膜电位的下降，可以阻断细胞凋亡[9]。本研究发现，DAG诱导BT325细胞凋亡，且5、10、20、40 μg/mL的DAG均可引起BT325细胞线粒体膜电位降低，其中20、40 μg/mL的DAG作用明显。推测DAG诱导BT325细胞凋亡的机制可能与降低线粒体膜电位有关。

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Effects of Dianhydrogalactitol on cell proliferation and apoptosis of human glioma BT325 cells and alternation in mitochondrial membrane potential

JIANGXia1,HUANGYingmei,WANGXiaojie,LIUHuagang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigative the effects of dianhydrogalacitol(DAG)on cell proliferation and apoptosis of human glioma BT325 cells and its potential mechanism. Methods BT325 cells were divided into the control group and DAG-treated groups at various oncentrations.CCK-8 assay and colony formation assay were performed to detect the cell viability of BT325 cells. Hoechst33342 was employed to observe nucleus morphological changes and apoptotic rate.The mitochondrial membrane potential (MMP) was detected by using Rhodamine 123 staining. Results With the increasing DAG concentration, the survival rate of BT325 cells decreased gradually (P<0.05). The survival rate of BT325 cells decreased with the prolonged incubation time in DAG-treated groups (allP<0.05). The IC50of BT325 cells treated by DAG were 108.81, 26.61, and 11.38 μg/mL at 24, 48, and 72 h, respectively.The result of colony formation assay showed that DAG inhibited clones of BT325 cells and the colony formation rate in the control group was 16.78%±1.50% (allP<0.01).The apoptotic rates of DAG-treated groups treated with 5, 10, 20, 40 and 80 μg/mL DAG were 11.79%±2.91%, 15.42%±3.06%, 38.70%±1.12%, 60.78%±1.30%, and 80.35%±3.22%, respectively,which were in an dose-dependent manner and were significantly increased as compared with that (4.27%±1.72%) of the control group (allP<0.01). The MMP of control group and DAG-treated groups(5, 10, 20, and 40 μg/mL) were 0.193±0.014, 0.174±0.038, 0.142±0.037, 0.138±0.033, and 0.119±0.013, respectively.Significant difference was found in the MMP between the DAG-treated groups (20 and 40 μg/mL) and the control group (P<0.05 andP<0.01).Conclusions DAG inhibits the proliferation and induces apoptosis of BT325 cells. It is suggested that decreased MMP levels might involve in the mechanism.

Dianhydrogalactitol; human glioma BT325; cell proliferation; apoptosis; mitochondrial membrane potential

广西壮族自治区自然科学基金资助项目(2015GXNSFAA139134)。

蒋霞(1974-)，博士，副主任药师，主要研究方向为抗肿瘤药物研究。E-mail： jiangxia771@sina.com

简介：刘华钢(1956-)，博士，教授，博士生导师，主要研究方向为抗肿瘤药物研究。E-mail： lhg@gxfda.gov.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.001

R739.41

A

1002-266X(2016)43-0001-03

2016-07-18)