自拟中药复方对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

邱 妍 ， 董发明 , 杨国栋 ， 林 霖

(河南科技大学动物科技学院 ， 河南洛阳471003)

自拟中药复方对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

邱 妍 ， 董发明 , 杨国栋 ， 林 霖

(河南科技大学动物科技学院 ， 河南洛阳471003)

为探讨自拟中药复方对免疫抑制小鼠的免疫调节作用，将女贞子、菟丝子、熟地、蒲公英、甘草按一定比例配伍，制备水煎液(质量浓度为1 g/mL)。将80只昆明系小鼠随机分为5组(空白对照组、免疫抑制模型组和中药复方高、中、低剂量组)，空白对照组和免疫抑制模型组小鼠灌服蒸馏水(0.2 mL/只)，复方高、中、低剂量组小鼠分别灌服300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只的复方水煎液，连续14 d。除空白对照组外，其他各组小鼠于给药的第1、3、5、7天皮下注射地塞米松(30 mg/kg体重)。试验第20天，将所有小鼠进行眼球采血，剖杀，称量体质量、胸腺重、脾脏重，计算胸腺、脾脏指数；分离血清，测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(INF-γ)的含量。结果显示，与免疫抑制模型组相比，复方中剂量组能够显著增加小鼠的胸腺和脾脏指数，提高小鼠血清中IgG、溶菌酶、IL-2、INF-γ的含量；而对IL-4含量无显著影响。可以得出：自拟复方水提液能够明显改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且这种调节作用与给药剂量有一定相关性。

中药 ； 小鼠 ； 免疫器官指数 ； IgG ； 溶菌酶 ； 细胞因子

近年来，在我国畜牧业生产中，畜禽免疫抑制正逐渐成为养殖场最为普遍的头号养殖难题，一些免疫抑制病，如猪的蓝耳病、圆环病毒病，禽的马立克病、传染性腔上囊病等，在养殖生产中流行较广，对畜牧业的影响相当严重。防治这类疫病的根本原则是使动物机体较低的免疫功能恢复，提高机体免疫力。目前有很多关于免疫增强剂的研究，其中中药类免疫增强剂，因其来源广泛、安全性高和调节机体阴阳平衡，符合无公害健康养殖的趋势，成为研究热点之一[1]。近些年,中药提取物是研究较多的中药类免疫增强剂，然而批量生产中药提取物相对繁琐，生产代价较高，很难在畜禽养殖中推广应用。中药复方是协同作用的基础，有利于发挥中药配伍的优势，生产工艺简单，更适合应用于畜牧生产。本试验选择了几种具有一定的免疫调节作用的中药：女贞子、菟丝子、熟地、蒲公英、和甘草[2-6]，配伍组成复方，所选中药具有调补阴阳，清热散痈的作用，且常见、廉价，能够降低用药成本。本试验拟通过观察不同剂量的复方水提液对免疫抑制小鼠几项免疫指标的影响，初步评价此自拟复方对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用，从而为进一步研究此中药复方对畜禽的免疫调节作用提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 供试动物 昆明系小鼠80只，雌雄各半，体质量为18±2 g。购自郑州大学实验动物中心。

1.2 中药和主要试剂 女贞子、菟丝子、熟地、蒲公英、甘草，购自张仲景大药房；地塞米松注射液(吉林敖东药业生产)；小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒，小鼠溶菌酶试剂盒，购自上海劲马生物有限公司；小鼠白细胞介素2(IL-2)ELISA试剂盒，小鼠白细胞介素4(IL-4)ELISA试剂盒，小鼠γ干扰素(INF -γ)ELISA试剂盒，购自上海邦奕商贸公司。

1.3 中药复方水煎液的制备 女贞子30 g、菟丝子20 g、熟地20 g、蒲公英30 g、甘草20 g，加水适量，浸泡1 h后煮沸，改用文火煎30 min，滤出煎液，药渣再加水煎煮，过滤，合并两次滤液，浓缩至每1 mL药液含生药1 g(1 g/mL)，备用。

1.4 试验动物的分组及处理 购回的小鼠在安静、清洁的条件下饲养，给予洁净营养饲料，先饲喂5-7 d以使其适应。将80只昆明系小鼠随机分为5组，每组16只(雌雄各半且分笼饲养，每笼8只)，分别为空白对照组、免疫抑制模型组和中药复方高、中、低剂量组。空白对照组和免疫抑制模型组小鼠灌服蒸馏水(0.2 mL/只)，复方高中低剂量组小鼠分别灌服不同剂量的复方水煎液，剂量为300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只，连续14 d。除空白对照组皮下注射生理盐水外，其他各组小鼠于给药的第1,3,5,7天皮下注射地塞米松(40 mg/kg)。

1.5 小鼠体质量、胸腺指数与脾脏指数的测定 各组小鼠采血后处死，称取体质量，解剖小鼠，取其脾脏、胸腺，用吸水纸浸干表面血液，称重，记录。计算小鼠胸腺、脾脏指数：胸腺指数=胸腺质量/小鼠体质量(mg/g)，脾脏指数=脾脏质量/小鼠体质量(mg/g)。

1.6 小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶含量的测定 试验第20天，对各组小鼠进行眼球采血。血液静置待凝固，2500 r/min离心5 min，分离血清，备用。按照说明书步骤操作，根据标准曲线计算含量。

1.7 小鼠血清中IL-2、IL-4、INF -γ含量的测定 按照说明书步骤操作，根据标准曲线计算含量。

1.8 数据处理 数据以Means ±SD表示，并用SPSS软件进行Duncan′分析，判断结果差异是否显著。

2 结果与分析

2.1 自拟复方对小鼠体质量、胸腺指数与脾脏指数的影响 本试验测定了自拟复方对免疫抑制小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数的影响，结果显示，复方高、中、低剂量组小鼠的体质量显著高于模型组(P<0.05)，中剂量组小鼠的平均体质量比模型组高3.03 g；复方高、中剂量组的脾脏指数显著高于模型组(P<0.05)，与空白对照组无显著差异(P>0.05)中剂量组小鼠的脾脏指数比模型组高0.47；复方高、中、低剂量组的胸腺指数均显著高于模型组(P<0.05)，高剂量组小鼠的胸腺指数比模型组高0.63，但复方组都显著低于空白对照组(P<0.05)。可见中剂量的复方可以提高免疫抑制小鼠的体质量和脾脏指数，使其接近正常小鼠的水平；对胸腺指数也有一定的提高，但仍显著低于正常小鼠(见表1)。

表1 自拟复方对小鼠体质量、胸腺指数、脾脏指数的影响

注：同行数据中肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，下表同

2.2 自拟复方对小鼠血清中IgG含量及溶菌酶含量的影响 本试验用ELISA法测定了各组小鼠血清中IgG和溶菌酶的含量。结果显示，复方高、中、低剂量组小鼠血清中的IgG含量均明显高于模型组(P<0.05)，复方中剂量组小鼠的IgG含量比模型组高41.79 ng/mL，且与对照组相比差异不显著(P>0.05)；复方中、低剂量组小鼠血清中溶菌酶含量均明显高于模型组(P<0.05)，中剂量组小鼠的溶菌酶含量比模型组高0.87 ng/mL，且与对照组相比差异不显著(P>0.05)。可见中剂量的复方可以提高免疫抑制小鼠血清中的IgG和溶菌酶的含量，使其接近正常小鼠的水平(见表2)。

表2 自拟复方对小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的影响

2.3 自拟复方对小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ含量的影响 本试验采用ELISA法测定了各组小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ的含量。复方高、中、低剂量组小鼠血清中IL-2含量显著高于模型组(P<0.05)，中剂量组比模型组高8.27 pg/mL，与空白对照组差异不显著(P>0.05)；复方高、中、低剂量组小鼠血清中IL-4含量低于模型组，但差异不显著(P>0.05)，与空白对照组差异也不显著(P>0.05)； 复方高、中剂量组小鼠血清中INF-γ含量显著高于模型组(P<0.05)，中剂量组比模型组高6.23 pg/mL，与空白对照组差异不显著(P>0.05)。可见中剂量的复方可以提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、INF-γ的含量，使其接近正常小鼠的水平，但是对IL-4无显著影响(见表3)。

表3 自拟复方对小鼠血清中几种细胞因子含量的影响

3 讨论

3.1 自拟复方对小鼠免疫器官指数的影响 脾脏和胸腺是机体中重要的淋巴器官，两者的功能与机体免疫状况紧密相关。免疫器官指数是衡量机体免疫状态的初步指标。在本试验中，注射地塞米松的小鼠体质量、脾脏和胸腺指数均显著低于正常小鼠，尤其以胸腺萎缩最为严重。灌服自拟复方后可以提高免疫抑制小鼠的体质量及免疫器官指数，其中复方中剂量组的体质量、脾脏指数和对照组小鼠相近，差异不显著。但是胸腺萎缩严重，灌服中药复方后，小鼠的胸腺也未能恢复到空白对照组小鼠的水平。有报道[7]杜仲叶多糖可以显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数，且达到正常小鼠的水平。与本试验结果不一致。但Ahmed S A曾报道[8]，糖皮质激素对免疫系统有明显的抑制作用，并且以胸腺的细胞凋亡最为明显，正常组织被破坏，且恢复较慢。可以解释本试验中为何脾脏指数基本恢复到正常水平，而胸腺指数未能恢复到正常。本试验证明了自拟复方对地塞米松引起的小鼠胸腺和脾脏萎缩具有一定的抵抗作用，从而间接的改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

3.2 自拟复方对小鼠血清中IgG和溶菌酶的影响 IgG是血清主要的抗体成分，约占血清免疫球蛋白总量的75%。主要是机体体液免疫应答中产生的。溶菌酶来自单核细胞、嗜中性粒细胞，能溶解某些细菌，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本试验结果显示，自拟复方高中低剂量均可以提高免疫抑制小鼠血清中IgG和溶菌酶含量，其中复方中剂量组与空白对照组小鼠的IgG含量相近，差异不显著。免疫小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的增加可以在一定程度上反映小鼠机体免疫能力的提高，合适剂量的自拟复方水提液可以使免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白和溶菌酶基本恢复到正常水平，进而改善小鼠的免疫状况。

3.3 自拟复方对小鼠血清中几种细胞因子含量的影响 细胞因子能介导和调节免疫应答，检测细胞因子水平可以反映机体的免疫状态。IL-2 主要由TH1 细胞分泌，参与细胞免疫反应; IL-4 主要由TH2 细胞分泌，参与体液免疫反应。IFN-γ主要由活化的Th1 细胞和NK 细胞所产生，并通过增强Th1 细胞活性而提高细胞免疫功能。本试验结果显示，中剂量的自拟中药复方可显著增加免疫抑制小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量，使其基本达到空白对照组健康小鼠的水平。表明自拟复方对免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的调节作用。卢舜飞等[9]也报道，刹毒草合剂可通过提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的浓度而发挥免疫调节作用。在本试验中地塞米松使小鼠血清中IL-4的含量升高，自拟复方使免疫抑制小鼠血清中IL-4的含量降低，但差异不显著，中药组与空白对照组差异也不显著。高光平等[10]试验证明，紫黄散和扶正解毒散均能明显提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 水平，与本试验结果不一致。也有报道[11]免疫抑制剂升高小鼠脾细胞中IL-4，中药归参汤可以降低IL-4水平，与本试验结果有一定的相似性。推测免疫抑制剂对机体IL-4的影响存在不确定性，但是最终机体内IL-2、IL-4的含量变化要使TH1/TH2达到一定平衡，具体调节机制还有待研究。

综上所述，自拟中药复方能够改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且这种增强作用与中药复方的用药剂量有一定相关性。本试验结果可以为进一步的研究提供理论参考。

[1] 晏继红,王仕宝, 刘文虎.中药免疫增强剂研究进展[J]. 西北药学杂志，2013,5:549-554.

[2] 张明发,沈雅琴.女贞子抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展[J]. 现代药物与临床, 2012,9:536-540.

[3] 张庆平，石森林.菟丝子对小鼠免疫功能影响的实验研究[J]. 浙江临床医学, 2006,8(6):568-570.

[4] 邹立君,侯胜超.香附配伍熟地对小鼠细胞免疫功能的影响[J]. 湖北中医杂志,2010,5:8-10.

[5] 于立恒.蒲公英药理作用研究进展[J]. 实用中医药杂志,2012,7:617-620.

[6] 田莉,曾斌芳,燕雪花.甘草在消化系统和免疫系统的药理作用及临床应用[J]. 新疆中医药,2009,4:91-93.

[7] 叶颖霞,林岚,赵菊香，等.杜仲叶多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J]. 中药材，2015,38(7):1496-1498.

[8] Ahmed SA,Sriranganathan N.Differential effects of dexamethasone on the thymus and spleen:alterations in programmed cell death, lymphocyte subsets and activation of T cell[J].Immunopharmacology, 1994, 28(1):55-66.

[9] 卢舜飞,汪亮亮,卢俊婉,等.刹毒草合剂对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中国应用生理学杂志,2015, 31(3):266-269.

[10] 高光平,张艳英,李艳云,等.紫黄散对免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4 和IFN-γ 的影响[J].黑龙江畜牧兽医(科技版),2015,7:205-207.

[11] 李慧峰,单明辉,程淑琴.归参汤对免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α和脾细胞TH1/TH2细胞因子的影响[J]. 中国兽医学报,2014,34(6):973-976.

The Effects of Self-made Chinese Medicine Compound on Immune Function of Immunosuppressive Mice

QIU Yan, DONG Fa-ming, YANG Guo-dong， LIN Lin

(College of Animal technology, Henan Science and Technology University, Luoyang 471003, China)

In order to investigate the immune regulation effect of a Chinese herbal compound by our own formulation on immune suppression mice,we selected Ligustrum lucidum,dodder seed,radix rehmanniae, dandelion and licorice,which were prepared for water decoction(concentration of 1g/ml) according to a certain proportion.Eighty Kunming rats were randomly divided into 5 groups:control group,immune suppression model group and traditional Chinese medicine compound group with high,medium and low doss.The mice of control group and immune suppression model group were administrated with distilled water (each 0.2ml).Each mouse from Chinese medicine compound with high, medium or low dose group was given different doses of the water decoction(300 mg, 200 mg and 100 mg,respectively)for 14 consecutive days.The mice except control group were injected with dexamethasone (30mg/kg) subcutaneously,at the 1st,3rd,5th,and 7th day after being given the water decoction.Blood was gained from the eyeballs of mice on the 20th day of the experiment,and then the mice were killed and body weight, thymus gland weight and spleen weight,were weighed and thymus index and spleen index were calculated.The content of serum immune globulin protein G (IgG), lysozyme, leukocyte mediated IL 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4) and interferon gamma (INF gamma) were determined after the serum separation.The experiment results showed that compared with the immune suppression model group,the Chinese medicine compound group of medium dose significantly increased the thymus and spleen index of mice, increased the content of serum IgG, lysozyme, IL-2, IFN gamma,but no significant effect on the content of IL-4.In conclusion,the Chinese herbal compound water extract by our own formulation can obviously improve the immune function of the immune suppression mice,and there is a certain correlation with the dose.

self-made Chinese medicine compound , mice , the index of immune organ , IgG , Lysozyme , cytokine

2015-08-18

河南科技大学博士启动基金(09001240)

邱妍 (1980-)，女，副教授，博士，主要从事中兽药相关研究，E-mail：qiuyan135@sina.com

S853.7

A

0529-6005(2016)11-0070-04