鹅巴氏杆菌与大肠杆菌混合感染的诊治

张 双 ， 柏亚铎 ， 李 欧 ， 胡桂学

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ；2.北京出入境检验检疫局 ， 北京朝阳100193；3.吉林省白城动物疫病预防控制中心 ， 吉林白城137000)

鹅巴氏杆菌与大肠杆菌混合感染的诊治

张 双1， 柏亚铎2， 李 欧3， 胡桂学1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ；2.北京出入境检验检疫局 ， 北京朝阳100193；3.吉林省白城动物疫病预防控制中心 ， 吉林白城137000)

禽巴氏杆菌病又称禽霍乱，是一种由巴氏杆菌引起的急性、接触性、败血性传染病，主要感染鸡、鸭、鹅等禽类。该病的临床特征表现为病禽食欲不振、体温升高、呼吸困难、腹泻等；剖检特征为心外膜散在针尖样点状出血、心包积液、心冠脂肪出血尤为严重，肝脏有白色细小坏死点，肠黏膜和腹部脂肪呈广泛的点状出血。大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的以败血症、心包炎、肝周炎以及禽气囊炎为主要特征的多种疾病的总称，常与其他病原菌混合感染或并发感染引起动物发病并导致患畜死亡[1-2]。2015年9月10日吉林地区某霍尔巴基鹅场鹅群出现大批量死亡现象，本实验室通过对该鹅场送检的6份病料进行临床剖检、细菌分离鉴定与药敏试验，对病鹅的病因作出了诊断并提出了针对性的治疗方案，为这类疾病的快速治疗和药物的合理使用提供了临床参考。

1 发病情况

2015年9月8日，吉林地区某鹅场突然有约5万羽(近1/10)霍尔多巴基鹅出现食欲下降、饮水减少、精神委靡、腹泻等症状。9月8日约有500羽鹅死亡，9月9日约1 200羽鹅相继死亡，9月10日鹅群出现大批量死亡，发病与死亡情况未见减轻。调查证明，该鹅场每年按正常免疫程序对鹅群进行小鹅瘟与新城疫二联苗免疫。

2 临床症状与剖检变化

患病鹅羽毛粗乱、精神沉郁、食欲下降、呼吸困难、鸡冠和肉髯发绀、口鼻流出黏液并伴有咳嗽、喷嚏，出现腹泻症状，排出绿色或白色的带有腥臭味米汤样稀粪。对患病鹅进行剖检，主要病理变化表现为纤维素性心包炎、心包积液、心冠脂肪处出现许多针尖状出血点，心脏和肝包膜呈白色浑浊，有明显的纤维素性附着物(见中插彩插图1A)；气囊浑浊、肥厚、有干酪样渗出物，肝脏有明显的白色针尖状坏死点(见中插彩插图1B)。

2.1 细菌的分离培养 无菌采集鹅的心脏、肝脏于含胎牛血清的TSA培养基上划线培养，得到两种形态不同的菌落，革兰染色镜检均为阴性杆菌。其中一类菌染色镜检为两极浓染的短杆菌或球杆菌，初步怀疑为巴氏杆菌；另一类菌镜检为染色均一的短杆菌，初步怀疑为大肠杆菌。分别挑取两种形态不同的菌落接种于TSB培养基进行纯培养，并标记为A、B菌液。

2.2 动物回归试验将20只昆明系小鼠(体重18 g～25 g, 购自长春实验动物中心)随机分为4组，Ⅰ组：腹腔注射0.2 mL菌液A；Ⅱ组：腹腔注射0.2 mL菌液B；Ⅲ组：腹腔注射0.1 mL 菌液A与0.1 mL 菌液B；Ⅳ组：腹腔注射0.2 mL TSB培养基。隔日观察，Ⅰ组小鼠全部死亡，Ⅱ组小鼠死亡3只，Ⅲ组全部死亡，Ⅳ组无死亡。

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 培养特性观察 无菌采集Ⅰ组小鼠肝脏于TSA培养基和伊红美蓝培养基划线培养，结果TSA培养基长出形态单一、灰白色、露珠状针尖大小的菌落，伊红美蓝培养基无菌落。采用相同方法对Ⅱ组小鼠肝脏进行划线培养，结果在伊红美蓝培养基上长出形态单一、黑色带有金属光泽的圆形菌落。

2.3.2 生化试验鉴定 分别将菌液A与B接种一组发酵管置于37 ℃恒温培养箱，培养48 h后观察结果。结果见表1，A菌液可以分解葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露糖产酸不产气，不发酵乳糖和麦芽糖，吲哚试验、硝酸盐利用试验呈阳性，M、R，试验、V-P试验、硫化氢试验等为阴性；B菌液可以分解葡萄糖、乳糖等多种糖类产酸或产酸产气，M、R，试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验为阳性, V-P试验、硫化氢、枸橼酸盐、尿素酶利用试验为阴性。生化试验结果显示，A菌液符合巴氏杆菌的生化特性，B菌液符合大肠杆菌的生化特性。

表1 分离菌的生化特性

+:阳性；—:阴性

图2 巴氏杆菌PCR鉴定

M：Marker DL-2 000； 1：检测样品； 2：阳性对照

2.3.3 PCR鉴定 分别以菌液A和菌液B为模板进行PCR鉴定，反应体系为无菌水17 μL，模板2 μL，dNTP2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，ExTaq0.5 μL，上下游引物各0.5 μL。A菌液PCR引物根据巴氏杆菌Kmt1序列(AF16259)设计，为F：5'-GGTCTTAGATGAGCGACAAGG-3'；R：5'-GCGCTATTACTTCCTTCGTTC-3'；B菌液采用16S rRNA通用引物。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，A菌液在460 bp处出现条带，长度与结果相符(图2)，经测序与Blast在线比对确定为巴氏杆菌。B菌液结果显示在1 700 bp处出现条带(图3)，经测序与Blast在线比对，结果与动物大肠杆菌E482同源性为98%。

图3 大肠杆菌16S rRNA鉴定

M：Marker DL-2 000； 1、2：检测样品

结合患病鹅临床剖检症状、通过细菌的分离、生化试验、PCR鉴定等，可推断A菌为巴氏杆菌，B菌为大肠杆菌。

3 敏感药物的筛选与治疗

3.1 药物敏感试验 按照世界卫生组织推荐的Kirby-Bauer氏法[3]，将纯化的巴氏杆菌和大肠杆菌菌液计数后分别涂抹于TSA培养基上，选取常见的15种药物进行药物敏感试验，结果见表2。表2结果显示15种常见抗生素中，2种菌敏感性较高的主要包括头孢曲松、磷霉素、庆大霉素与氯霉素。

3.2 治疗 根据药物敏感试验结果以及药物杀菌作用机制和经济价值等因素，最终选用磷霉素可溶性粉末为临床治疗药物。将磷霉素可溶性药粉溶于鹅群日常饮用水中，每升水30 mg～60 mg,早晚各1次,持续用药观察发病情况。结果给药3 d后鹅群死亡率明显降低，5 d后几乎无发病情况。

4 分析与讨论

巴氏杆菌病是由巴氏杆菌引起的一种畜禽共患传染病，巴氏杆菌通过呼吸道、消化道、损伤皮肤以及血吸昆虫等传播感染，主要侵害家禽和野生动物，并且具有较高的发病率和死亡率，其中幼龄动物最易感染，死亡率也较高[4]。大肠杆菌病是由大肠埃希菌中的某些致病性血清型菌株引起的疾病的总称，主要通过消化道感染，一般表现为继发感染，一年四季均可发生。巴氏杆菌与大肠杆菌混合感染在畜禽养殖中较为普遍，在梅花鹿、牛，鸭等养殖中已有相关报道，并对我国的畜禽养殖业造成了很大的经济损失。目前，对于巴氏杆菌和大肠杆菌的诊断方法主要包括ELISA抗体捕获法、特异性PCR诊断方法、ERIC-PCR检测方法、多重PCR方法以及常规实验室诊断与血清学诊断方法[5]。

表2 巴氏杆菌对15种常用药物的敏感性试验结果 (抑菌环直径单位：mm)

本试验通过对患病鹅进行临床症状观察，并对病料进行了细菌的分离培养以及培养特性观察、生化试验、分子生物学诊断，确诊为巴氏杆菌与大肠杆菌混合感染。造成混合感染的主要原因是由于鹅场饲养管理不当，禽舍消毒不彻底，环境潮湿等，造成了大量的病原菌滋生。当鹅群机体抵抗力较弱时，强毒菌趁机侵入并迅速进入血液，造成败血症导致发病，并伴随大肠杆菌的继发感染，导致鹅群的大量死亡。通过药物敏感试验筛选出对分离到的巴氏杆菌与大肠杆菌均高度敏感的抗生素，主要包括头孢曲松、磷霉素、庆大霉素与氯霉素。结合两种细菌的药物敏感性，依据药物的杀菌机制和经济价值等因素，采用敏感的磷霉素作为临床用药，收到了良好的治疗效果。

试验中采用的临床剖检结合传统细菌分离培养、生化试验、分子生物学诊断的组合诊断方法为该鹅场患病鹅的治疗节省了宝贵时间，使药物对该病的治疗提供了更有利的条件，同时为基层兽医临床细菌学诊断提供了技术支持。采用的药物敏感试验，筛选敏感药物并结合药物杀菌机制和经济价值的药物选择方法为临床合理用药提供了参考意见。

[1] 刁有祥, 李久芹, 陈庆普. 山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2002, 24(1): 52-56.

[2] 申圣林, 夏礼杰, 徐增强. 肉鸭霍乱并发大肠杆菌病的诊断[J]. 现代农业科技, 2015, 11: 293-294.

[3] 范欢, 陈帆, 温学峰, 等. 丹顶鹤大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医杂志, 2009, 45(6): 81-82.

[4] 陈庆勋. 牛巴氏杆菌病与附红细胞体病混合感染的综合防治[J]. 中兽医医药杂志, 2012, 31(6): 45-46．

[5] Hricinova M, Holoda E,Mudronova D,etal. MULTIPLEX PCR assay for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis in lungs of pigs from a slaughterhouse [J]. Folia Microbiol, 2010, 55: 635-640.

2015-12-02

吉林省重大科技攻关项目(09ZDGG008)

张双(1988-)，男，硕士，主要从事动物病毒学研究，E-mail:benxiaohaigogo@126.com

胡桂学，E-mail: huguixue901103@163.com

S858.31

B

0529-6005(2016)11-0057-03