两株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的感染试验

王 云，周西贝，陈春艳，张海军，谢映平

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.阳泉市林业科学研究所，山西阳泉045000）

两株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的感染试验

王 云1，周西贝1，陈春艳1，张海军2，谢映平1

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.阳泉市林业科学研究所，山西阳泉045000）

核桃举肢蛾的发生影响着核桃的产量和品质。为了寻找新的生物防治途径，于2014年8月从山西盂县核桃产区收集受核桃举肢蛾钻蛀的虫果进行解剖观察，发现在核桃举肢蛾钻蛀的初期、中期、后期和末期，核桃果实受害症状呈现不同的特点，包括果皮黑斑、果实内幼虫蛀食果肉形成的坑道和蛀孔的大小、排泄的虫粪量、幼虫的体色和体长。在虫果内核桃举肢蛾的幼虫数量平均为6～7头，最多的可达13头。利用球孢白僵菌的2个菌株TST05和FDB01的孢子悬浮液（孢子浓度为1.0×108个/mL）对新脱果的核桃举肢蛾老熟幼虫进行了感染试验。结果显示，2菌株对该幼虫均具有很好的感染和致病效果，感染第2天就表现出染病症状，随后虫体表面出现菌丝，最后完全被菌丝覆盖；第8天的校正死亡率分别为87.8%和84.4%；致死中时分别为4.743，4.934 d。

核桃举肢蛾；球孢白僵菌；感染；生物防治

核桃是我国主要的传统经济树种之一，近十几年来核桃产量稳步增长，发展速度较快。全国核桃总产量由2001年的25.23万t增加到2011年的165.55万t[1-2]。山西是核桃主要产区，目前栽植面积约34万hm2，产量约9万t，位居全国前列[3]，对发展山区经济和农民脱贫致富具有重要作用。核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei Yang）是核桃的蛀果害虫，其属鳞翅目（Lepidoptera）举肢蛾科（Heliodinidae），以幼虫蛀入果内取食果肉和核仁，受害的核桃果实干缩，果皮变黑，故称“核桃黑”。在河南、河北、山西、陕西、四川、山东、甘肃、北京等省市均有发生[4]。山西省的太行山区是核桃举肢蛾严重发生区，盂县调查数据显示，核桃举肢蛾危害的虫果率达60%左右，严重的可达90%以上[5]。在陕西商洛，核桃举肢蛾危害造成的黑果率为82.60%[6]。核桃举肢蛾的防治以在成虫期用化学农药喷洒树冠为主，但对已经蛀入果实内的幼虫起不到防治作用，而且化学农药的长期使用造成了农药残留、环境污染和果品安全等问题。

利用昆虫病原真菌作为生物防治因子对害虫进行种群控制是当前世界害虫生物防治的一个发展方向，其已在松毛虫等食叶性害虫的防治中取得显著成绩[7]。David等将球孢白僵菌喷洒在树干上防治美洲山核桃象鼻虫（Curculio caryae Horn），致死率可达80%以上[8]。但在防治核桃举肢蛾这类蛀果害虫方面还很少有报道，这与害虫钻蛀进入果实后施用病原菌制剂无法接触到害虫有关。陶训等[9]利用从桃小食心虫幼虫上分离的白僵菌进行防治试验，结果证明具有较好的感染效果。近几年，山西大学昆虫分子与害虫生物防治实验室根据松毛虫幼虫、松叶蜂幼虫和桃小食心虫幼虫具有入土越冬习性，研究在土壤中施用昆虫病原真菌，对害虫进行防治，结果发现具有较好的感染效果。同样，我们发现，核桃举肢蛾虽然幼虫钻蛀在果实内危害，但秋季幼虫老熟后会钻出核桃果实，在核桃树下表土层内结茧越冬，一直到第2年的五六月份才羽化出土，在土壤中栖息的时间长达9个月。在此期间，对入土的幼虫进行生物防治，充分利用表土层利于昆虫病原真菌存活和感染的温湿度等条件，形成防治核桃举肢蛾的新技术，从而减少在树冠上喷洒农药。

本研究在山西阳泉地区的盂县核桃产区进行布点观察，采集虫果，解剖并观察核桃举肢蛾幼虫对核桃果实的蛀食情况，掌握幼虫的发育和脱果进度。并利用实验室从桃小食心虫幼虫和松叶蜂幼虫上分离的2株高致病性球孢白僵菌菌株，对核桃举肢蛾幼虫进行感染试验，旨在为核桃举肢蛾的生物防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验林地设在山西省阳泉市盂县南小坪村核桃林。核桃树为30年生的大树，树高为10～15 m，核桃结果较多，未采取任何防治措施，近几年的虫果率达80%以上。

1.2 核桃举肢蛾幼虫在果实内的危害和脱果观察

2014年8月中旬，在核桃林地采集被核桃举肢蛾钻蛀的虫果，带回实验室进行解剖，镜检观察核桃举肢蛾幼虫在果实内的取食和危害情况。根据果皮黑斑、幼虫在果内钻蛀形成的孔和坑道、排泄的虫粪、幼虫的体长和体色、幼虫钻蛀数量等指标，分析核桃举肢蛾幼虫在果内为害的时间长短和发育进度。并观察核桃举肢蛾幼虫的自然脱果情况。

1.3 2株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的感染试验

昆虫的收集：将采集的虫果放置于室内，收集自然脱果的核桃举肢蛾健康幼虫，放于洁净的培养皿内保存，用于感染试验。

菌株培养及孢子液的制备：将实验室已有的2株球孢白僵菌TST05（由山西省襄汾县桃小食心虫越冬幼虫上分离获得，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC4526）和FDB01（由吉林省伊通县红松林帕克阿扁松叶蜂幼虫上分离获得）接种于PDA培养基上，置于人工气候箱中（温度（25±1）℃、相对湿度70%±10%，光照周期14∶10（L∶D））培养7～10 d，然后将菌丝刮于含有0.1%Tween-80的无菌水中制成孢子悬浮液，检测分生孢子浓度，配制成浓度为1.0×108个/mL的孢子悬浮液。

幼虫的感染和效果观察：从收集的老熟幼虫里挑选大小一致的健康幼虫，每组30头，设3个重复，采用浸虫法感染体表。置于人工气候箱中进行培养（温度（25±1）℃、相对湿度70%±10%，光照周期14∶10（L∶D）），每天观察、记录死亡情况。幼虫死亡后进行保湿培养，看是否有白色菌丝长出，并计算校正死亡率和致死中时。

2 结果与分析

2.1 核桃举肢蛾幼虫在核桃果实内的为害状

2014年8月从阳泉盂县采集核桃举肢蛾钻蛀的虫果（图1-A）。将虫果按受害程度分为为害初期、中期、后期和末期（图1-B）。为害初期，核桃举肢蛾幼虫钻蛀进核桃内的时间尚短，核桃的果皮仍为青绿，在核桃青皮和果肉内可观察到幼虫较小，钻蛀的虫孔和坑道都比较细小（图1-C）。为害中期，核桃的青皮上出现黑色斑块，幼虫在核桃果实内取食和发育已经有较长时间，虫体已经长大，核桃果肉被大量蛀食，形成纵横交错的黑色坑道，并有明显的虫粪（图1-D）。为害后期，核桃果皮大部分变黑，果肉的大部分已被幼虫蛀食，形成许多的虫孔和坑道，坑道内充满大量虫粪（图1-E）。为害末期，核桃果皮完全变黑，幼虫发育接近成熟，果肉几乎被完全蛀食，只剩下大量的虫粪（图1-F）。另外，可以看到一些幼虫已经在核桃种皮木质化前蛀入种仁，在种仁内蛀食，并排泄粪便（图1-G，H）；由于幼虫蛀食，导致核桃种仁发育不良、干缩变黑（图1-I）。

据统计，在核桃举肢蛾钻蛀的核桃内幼虫的数量平均为6～7头，多的可达13头。幼虫老熟后在果实上蛀孔钻出，刚脱果幼虫的体长为6～9 mm；头部黄褐色，虫体色浅，淡红，半透明，腹部末端2节呈白色（图1-K，L）。

2.2 2株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的感染效果

探究2株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫的感染情况，制备TST05和FDB01等2个菌株的孢子悬浮液，感染健康的核桃举肢蛾幼虫。试验结果表明，被2个菌株感染的核桃举肢蛾幼虫，在第2天幼虫活力有所下降，第3天幼虫开始相继死亡，虫体的表皮失去光泽，发黄变暗，逐渐萎缩干瘪（图2-A，E）；第5天从虫体表面长出一些白色菌丝（图2-B，F）；第8天死亡虫体僵硬，体表长满白色菌丝（图2-C，G）；第12天虫体完全被菌丝萌发出的白色孢子覆盖（图2-D，H）。证明2个菌株对核桃举肢蛾幼虫均有侵染效果。

经检测，2株球孢白僵菌TST05和FDB01（孢子悬浮液浓度为1.0×108个/mL）对核桃举肢蛾幼虫均表现出较高的致病力。由图3可知，感染后第3天，TST05和FDB01菌株感染的校正死亡率分别为14.4%和10.0%；感染后4～6 d，幼虫的死亡率迅速增高，第6天TST05校正死亡率达66.67%，FDB01校正死亡率达到73.3%；感染后6～8 d，幼虫死亡速率减慢，到达第8天时，TST05校正死亡率为84.4%，FDB01的校正死亡率达到了87.8%。在感染后1～4 d，菌株TST05的校正死亡率大于菌株FDB01，4 d后菌株FDB01的校正死亡率超过了菌株TST05。菌株TST05，FDB01对核桃举肢蛾越冬幼虫的致死中时（LT50）分别为4.934，4.743 d，差别较小（表1）。2株球孢白僵菌对核桃举肢蛾幼虫都有较高的校正死亡率和较短的致死中时。

表1 2个菌株对核桃举肢蛾幼虫的致死中时

3 讨论

核桃在我国栽培历史悠久，分布广泛。核桃举肢蛾为害是造成核桃减产绝收的主要原因之一。核桃举肢蛾幼虫在核桃果实内蛀食，形成纵横交错的坑道，造成果皮变黑、皱缩，早期落果，给果农造成巨大的经济损失。据20世纪90年代调查，在山西的盂县、左权、黎城等9个县的核桃产区，平均虫果率为47.7%，严重的达90%以上[5]。陕西商洛地区危害严重年份，黑果率可达42%～70%，产量损失40%，出仁率降低30%，含油量降低35%[10]。

以往的化学防治是在树冠连续多次喷洒药剂，消灭成虫和蛀果前的幼虫，可以达到一定的防治效果[11]。张坤朋等[12]在成虫发生高峰期，树冠喷洒毒死蜱、苦参碱等化学农药，防治效果可达80%以上。田士波等[13]将水溶性药剂注入核桃树干，使之在树干内运行，进入核桃果皮和果仁内，结果证明可达到较好的防治效果。另外，结合刨树盘和土壤施用化学杀虫剂，防治入土越冬的幼虫和羽化出土的成虫，具有一定的效果[14]。但是，连续的化学防治会引起环境污染、害虫抗药性等问题。采用性引诱剂诱杀，对核桃举肢蛾的防治效果仅有12.5%～22.2%，虫果率仅下降2.2%～2.6%，防治效果不明显[15]。田敏爵等[16]研究表明，在核桃举肢蛾成虫期、卵期、幼虫蛀果前期采用苏云金杆菌喷雾可有效降低虫果率。王永宏等[17-18]利用斯氏线虫和芜菁夜蛾线虫悬浮液，在不同时期喷洒核桃树下土壤，对核桃举肢蛾有一定的防治效果。

白僵菌是国内外研究和应用最为广泛的虫生真菌类群[19]。本研究通过选用球孢白僵菌TST05和FDB01菌株对核桃举肢蛾幼虫进行感染试验，结果发现2个菌株对核桃举肢蛾老熟幼虫都有较高的致病力，表现为致死速度快，致死率高，其致死中时（LT50）分别为4.934，4.743 d，第8天的致死率分别为84.4%和87.8%。这为核桃举肢蛾的生物防治提供了菌种资源。另外，球孢白僵菌与田间使用的几种主要化学杀虫剂有着较好的相容性，当白僵菌在土壤中遇到化学杀虫剂时，对菌株的宿存和防治效果不会有较大影响[20]。白僵菌在自然界的生存和感染通常需要合适的温度、湿度等条件，根据核桃举肢蛾老熟幼虫脱果后具有入土结茧的习性，再结合通常的刨树盘的管理措施，在土壤中施用白僵菌制剂，既能发挥土壤环境利于白僵菌存活的优势，又能利用白僵菌高效感染致病的特点，为核桃举肢蛾生物防治提供了一种简便易行的新方法。

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Infestation Experiment of Atrijuglans hetaohei Yang Larvae with the Two Strains of Beauveria bassiana

WANG Yun1，ZHOU Xi-bei1，CHEN Chun-yan1，ZHANG Hai-jun2，XIE Ying-ping1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Yangquan Forestry Science Research Institute，Yangquan 045000，China）

The infestation and damage of the pest Atrijuglans hetaohei Yang greatly reduced the yield and quality of walnut.To develop a new way for the pest biological control,the walnut fruits with larvae of Atrijuglans hetaohei were collected from Yuxian county in Shanxi province and were dissected and observed.The investigation showed that as the larvae boring the walnut fruits in early, medium,later,and final stage,different symptoms exhibited on the damage walnut fruits,including the black spots of walnut pericarp,the size of galleries and holes caused by larvae boring,quantity of faeces,color and length of larvae.The average number of the larvae inside of the infested walnut fruits was 6-7,but the most number could reach to13 in one walnut fruit.Two strains of Beauveria bassiana TST05 and FDB01（sporeconcentration was 1.0×108/mL）were used to infect the mature Atrijuglans hetaohei larvae.The result showed that the two strains were very good in infection and pathogenicity to the larvae.On the second day after infection,the larvae showed the diseased symptom,later mycelia appeared on the surface of the larvae,at last the dead larvae was completely covered with a thick of mycelia.On the eighth day,the mortality rate reached 87.8%and 84.4%in the two strains infection,respectively,while the LT50of the two strains were 4.743,4.934 d,respectively.

Atrijuglans hetaohei Yang;Beauveria bassiana;infestation;biological control

S436.64

A

1002-2481（2016）05-0662-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.21

2016-01-05

山西省科技攻关项目（20140311017-6）

王 云（1988-），男，山西晋城人，在读硕士，研究方向：昆虫病原真菌与生物防治。谢映平为通信作者。