玉米秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建

■宋云皓 满都拉 郜晋楠 段开红 田瑞华

(1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018)

内蒙古自治区是我国玉米种植大省，占全国玉米生产的10%。2015年，内蒙古自治区玉米种植总面积约为5 111万亩。一般粒用玉米亩产秸秆3～5 t，按此计算，2015年内蒙古自治区玉米秸秆产量约为1.5～2.6亿吨[1]。由于地理及气候特点，内蒙古自治区农业和牧业生产具有明显的地域性差异。玉米种植区主要集中在通辽市、兴安盟、赤峰市及乌兰察布盟等地区，而牧区主要集中在呼伦贝尔盟、锡林郭勒盟及阿拉善盟。一方面，由于气候的变化，天然草地的退化及过度放牧，牧业区对饲草料的需求逐年增加。另一方面，可作为饲料的秸秆在农业区的主要利用方式为生活能源燃料，没有做到物尽其用。因此，对于内蒙古地区的玉米秸秆的利用方式应以饲用为主。但是，由于玉米秸秆的组成大部分为纤维素类物质，其中含约37%的纤维素、17%的半纤维素及28%的木质素（占干物质重）[2]，导致直接饲用后大部分未被吸收而直接排出，利用率较低[3]。大量研究表明，对秸秆进行预处理能够疏松其结构，增加采食量，提高秸秆饲用效率[4-5]。

目前，玉米秸秆的处理方式有酸碱化学处理法[6-8]，粉碎物理处理法[9]以及生物处理法[10-14]等。其中，由于生物处理法具有使秸秆纤维素含量下降、提升蛋白含量、操作简便及环保等优点，在研究秸秆饲用领域受到广泛关注[15]。生物处理法是利用微生物产生的纤维素降解酶作用于纤维素、半纤维素以及木质素，从而达到使玉米秸秆结构疏松的目的。且相关微生物之间复配能显著提高秸秆降解能力[16-18]，软化秸秆[19]，提高牛羊的进食率[20]。

基于内蒙古自治区秸秆利用方式及气候特点，本研究从内蒙古自治区东部（通辽和赤峰）筛选纤维素降解菌，并对其进行复配，构建复合菌系，为进一步提高玉米秸秆饲用推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验样品采自内蒙古自治区赤峰市及通辽市郊区的腐烂玉米秸秆、牛羊圈土壤。土样品过20目筛，与秸秆样品分别装入无菌袋带回并保存于4℃冰箱中。

富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5.0 g、秸秆粉 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然。

筛选培养基：K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、蒸馏水1 000 ml，取10 ml装入50 ml试管中，再向试管中加入滤纸条（剪为5×0.7 cm），纸条贴在内壁上，一半浸入培养基液面以下。

分离培养基：CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、刚果红0.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然。

发酵培养基：CMC-Na 10.0 g、K2HPO41.0 g、Mg-SO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏 2.5 g、胰蛋白胨 5.0 g、蒸馏水 1 000 ml，pH值自然。

1.2 秸秆中兼性厌氧菌的筛选及分离纯化

将样品装入250 ml三角瓶中，加满水至瓶口，封口膜封口，30℃静置培养3 d。吸取10 ml培养液加入富集培养基中（250 ml三角瓶加200 ml），30℃下富集培养3 d。

吸取富集培养物1 ml加入筛选培养基中，30℃培养2周。选择滤纸崩解程度较高的试管稀释至10-6、10-7、10-8梯度，将菌液涂布在分离培养基上，再倒一层琼脂，30℃培养3 d。待双层平板长出单菌落后，用接种针挑取产生刚果红透明圈的菌株，接种到分离培养基后30℃培养3 d。在菌落周围能产生透明圈的证明该菌株具有分解纤维素能力。

1.3 指标的测定

1.3.1 酶活的测定

将筛得菌株接种于发酵培养基中30℃培养5 d，将发酵液在4℃、6 000 r/min、10 min后收集上清液即为粗酶液，利用3，5二硝基水杨酸法（DNS法）测定发酵液的酶活[21]。

1.3.2 秸秆中粗纤维含量的测定

按照国标（GB/T 6434-2006）中的方法测定秸秆中粗纤维的含量。

1.4 菌种鉴定与构建复合菌系

利用平板划线法分离单菌落后观察其菌落形态特征。利用引物27F和1492R扩增所筛微生物16S rDNA，送测序公司测序后，将序列与NCBI数据库进行比对。根据比对结果及形态特征确定所筛菌株的种属。

将两种不同的菌株采用两两相交划线的方法接种于拮抗培养基中，得到菌株间拮抗关系后，结合酶活结果构建复合菌系。

1.5 数据分析

每个处理设3次重复，当P＜0.05时，视为处理之间差异显著。数据分析及绘图利用Office Excel 2015完成。进化树利用MAGA 6.0完成。

2 结果与讨论

2.1 纤维素分解菌的筛选

通过对样品富集培养后，分离纯化出具有纤维素分解能力菌57株，并根据酶活初步筛选出14株有CMC酶活的菌株，观察菌落形态（如表1所示）。由表1可以看出，无色透明菌落的检出率较高，形态特征多样。菌株8-2的CMC酶活较高，但没有透明圈产生。菌株9、菌株6-4的CMC酶活很低，但有透明圈产生，可见透明圈大小只能初步反映出菌株的酶活高低。通过酶活大小的比较得出，直接从干玉米样品中筛菌所得到的菌株CMC酶活均不高，这可能是由于干样品中缺少水分，不利于菌株的存活。CMC酶活较高的菌株大多为在田地中有腐烂根茎的土样中所筛得。这与吴文韬[22]和李波[23]等人的结果类似。由于菌株6-4、菌株9、菌株12、菌株14-5这4株菌较其他菌株酶活较低，因此不对此4株菌进行进一步的研究。

表1 所筛菌株的酶活、透明圈直径及形态

2.2 16S rDNA序列分析

通过NCBI在线比对，株菌3-4、14-1、2-4和菌株6-9属于芽孢杆菌属（Bacillus），Blast比对相似度均为99%，酶活相对较高，这与张斯童等人的结果类似[24]。1-3、8-2和6-2属于肠杆菌属（Enterobacter），Blast比对相似度为98%、99%和99%。菌株5-2、11-2和菌株10分别属于非脱羧勒克菌属（Leclercia adecarboxylata）、泛菌属（Pantoea）及柠檬酸菌属（Citrobacter），Blast比对相似度均为99%。各菌株进化关系如图1所示。

由于真菌和放线菌有较高的纤维素酶活[25]，如魏亚琴等[26]筛选出来的菌株CMC-Na酶活可高达1 181 U。但是，真菌及放线菌的生长较细菌缓慢且副产物多，且对其进行进一步优化改造较难。因此本研究针对性的筛选降解纤维素细菌。从系统发育树可以看出（图1），具有较高CMC-Na酶活的菌株大部分为芽孢杆菌属。有研究表明[27]，芽孢杆菌在作为饲料添加剂时，可以产生较多的生物热，具有耐酸、耐高温能力，在进入动物肠道后可以成为营养性细菌、提高饲用率、增强动物免疫力。因此，在下一步构建复合菌系时，以芽孢杆菌属菌株为主，配以其他菌属细菌，从而达到提高酶活的目的。

2.3 复合菌系的构建及秸秆发酵实验

将所筛菌株两两划线接种于无刚果红的分离培养基中，观察线迹有无萎缩断开现象（结果如表2所示）。根据各菌株之间的拮抗结果利用无拮抗作用的菌株构建复合菌系。

微生物的拮抗作用是指一种微生物在其生命活动中产生某种代谢产物或改变环境条件，从而对其他微生物产生抑制或毒害作用[28]，而芽孢杆菌本身就有较强的抑菌活力[29]，所以本实验中与芽孢杆菌出现的拮抗作用的菌株较多。

根据拮抗实验结果，构建5组复合菌系A:1-3、5-2、6-2和11-2；B:3-4、6-9、5-2和8-2；C:2-4、5-2、8-2和11-2；D:10、2-4和8-2；E:14-1、3-4和8-2。在李静等[30]的研究中，通过对Paenibacillus、Bacillus、Acinetobacter来进行复配，得到的结果为复合菌系比单菌株对秸秆的降解率相比提高了50.71%。由此可见利用构建复合菌系的方法可以在提高秸秆降解率的过程中起到十分关键的作用。

利用DNS法分别测定5组菌系酶活（见图2）后发现，菌系B的酶活最高。大量的研究表明[31-34]，Bacillus是高效的纤维素分解菌，Shrinivas[35]和Kumar等[36]指出，Bacillus可以分泌出降解纤维素的酶，促进纤维素降解。从结果来看，虽然Enterobacter构成的菌系酶活较低，但在由Bacillus和Enterobacter构成的菌系中酶活的提升较为明显。因此，在菌系的构成时，酶活较低的Enterobacter也起到了显著的作用。

图1 所筛纤维素降解菌的系统发育树

表2 所筛纤维素降解菌的拮抗性

图2 复合菌系的酶活

以1%接种量将复合菌系接入含水率为70%的玉米秸秆后，真空密封，置于30℃发酵。7 d后测得秸秆中的粗纤维降解率达到了48.6%。

目前内蒙古自治区对玉米秸秆的处理方式主要以就地焚烧为主，这不仅会污染空气、浪费资源，而且由于在焚烧的过程中会产生高温破坏土壤内的菌群结构，为来年的生产造成困难，所以如何科学地利用玉米秸秆是本研究的核心。本研究针对内蒙古自治区的特点提出了秸秆饲用的观点并分离与纯化玉米秸秆纤维素降解菌、构建复合菌系，为进一步开发内蒙古自治区玉米秸秆饲用资源奠定基础。

3 结论

以内蒙古东部地区为研究区域，分离纯化出10株具有较高CMC酶活的纤维素降解菌1-3、2-4、3-4、5-2、6-2、6-9、8-2、10、11-2和14-1。并进一步构建了复合菌系A:1-3、5-2、6-2、11-2；B:3-4、6-9、5-2、8-2；C:2-4、5-2、8-2、11-2；D:10、2-4、8-2和E:14-1、3-4、8-2。其中菌系B的CMC酶活较菌株3-4（所筛菌株中酶活最高）提高了105.07%，可见，复合菌系能够显著提高酶活力。玉米秸秆发酵实验表明，复合菌系B处理过的秸秆粗纤维降解率达到了48.6%。