刺五加多糖对白痢仔猪粪便大肠杆菌的抑菌效果研究

韩 杰，周子琳，许人骥

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866；2.中国环境监测总站，北京 100012）

刺五加多糖对白痢仔猪粪便大肠杆菌的抑菌效果研究

韩 杰1，周子琳1，许人骥2*

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866；2.中国环境监测总站，北京 100012）

本试验采用纸片试验法研究了刺五加多糖（ASPS）对黄白痢仔猪粪便中大肠杆菌的抑制作用。结果表明，ASPS对白痢仔猪粪便大肠杆菌有一定的抑制作用，640 mg/mL ASPS对大肠杆菌的抑制效果最明显，最小抑菌浓度（MIC）为160 mg/mL。与氧氟沙星抑菌活性比较发现，160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌能力分别约为氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%。

刺五加多糖；仔猪；大肠杆菌；抑菌活性

仔猪白痢是由致病性大肠杆菌引起新生仔猪的一种急性传染病，多发于一月龄的仔猪，发病率与死亡率相对较低，但会对仔猪的生长与发育造成严重的影响[1]。刺五加（Acanthopanax senticosus）又名西伯利亚人参、五加参、南五加皮和刺拐棒等，主要分布于我国的东北、华北地区和俄罗斯、朝鲜、日本等地[2]。其中，刺五加多糖（ASPS）是刺五加活性成分中含量最高、作用最广泛的功能因子之一[3]。以往研究已经表明，刺五加多糖具有调节断奶仔猪肠道微生物区系的作用[4]。但关于应用ASPS对仔猪白痢的影响研究还未见报道。本试验研究ASPS对白痢仔猪粪便大肠杆菌的抑制作用，为应用ASPS预防和治疗仔猪白痢提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1 白痢仔猪粪便 采自某猪场。

1.1.2 ASPS 采用水提醇沉法，将刺五加根置于55℃烘箱干燥、粉碎、过筛。取过筛后的刺五加根粉加蒸馏水煮沸3 h，重复提取3次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至1:1，然后在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸，反复震荡，离心，加入3倍体积80%乙醇加热搅拌提取2次，每次1 h，离心，合并两次的沉淀物用丙酮洗涤，沉淀物经冻干后得到棕色粗ASPS。将ASPS粗品纯化，用苯酚-硫酸法分析ASPS含量为92.7%。

1.1.3 盐酸左氧氟沙星 由常州华生制药有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1 培养基的制备 牛肉膏培养基：取2.5 g牛肉膏、5 g蛋白胨、2.5 g氯化钠和10 g琼脂，用500 mL水稀释并加热煮沸至琼脂完全溶解，用10%氢氧化钠溶液或10%盐酸溶液调节pH至7.2～7.6，并于121℃高压灭菌20 min，备用。

肉汤培养基：取0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5g氯化钠，用100 mL水稀释并加热煮沸完全溶解，用10%氢氧化钠溶液或10%盐酸溶液调节pH至7.2～7.6，并于121℃高压灭菌20 min，备用。

1.2.2 白痢仔猪粪便中大肠杆菌的分离培养和鉴定用灭菌棉签沾取白痢仔猪粪便，分别放入含5 mL肉汤培养基的试管中，于37℃恒温培养箱中培养24 h。制作麦康凯培养基，将上述活化24 h后的试管取出，接种在麦康凯培养基上培养24 h，在麦康凯培养基上选出大肠杆菌菌群，接种在牛肉膏培养基上培养。之后利用糖发酵管生化试验鉴定大肠杆菌，将在牛肉膏培养基上培养的大肠杆菌接种在糖发酵管中培养24 h，如果使葡萄糖，乳糖产气，并由紫色变成色，即可以鉴定为大肠杆菌。

1.2.3 刺五加多糖最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用平板划线法。在培养基上划线培养细菌。配制100 mg/mL的ASPS溶液，用两倍法稀释ASPS溶液浓度，形成10、20、40、80、160、320、640 mg/mL等7个浓度梯度。采用滤纸片法，将浸泡于ASPS溶液中2 h的直径为6 mm的灭菌滤纸片均匀放置于平板上，每平板放6片。然后将细菌平板置37℃培养24 h。

1.2.4 刺五加多糖的抑菌效果测定 采用与上述1.2.3相同的滤纸片法，测定各浓度ASPS的抑菌效果。游标卡尺测定抑菌圈直径的大小，重复3次。

1.2.5 左氧氟沙星溶液对各种供试菌的抑菌效果配制1 mg/mL左氧氟沙星溶液。测定左氧氟沙星对各供试细菌的抑菌效果。无菌水做参照。方法同于1.2.4。

1.3数据的统计分析试验数据经Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 19.0统计软件中的单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，采用Duncan氏法进行多重比较检验，数据结果表示为“平均值±标准误”，P＜0.05时确定为差异显著。

表1 刺五加多糖对大肠杆菌的最小抑菌浓度Table1 Minimum inhibitory concentration of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli

2 结果与分析

2.1刺五加多糖对大肠杆菌最小抑菌浓度（MMIICC）的测定用二倍法稀释多糖溶液，通过对抑菌圈直径大小的变化测定ASPS的最小抑菌浓度。抑菌圈直径为≤6 mm、6～8 mm、8～10 mm、≥10 mm依次用“-”、“+”、“++”、“+++”表示[5]。结果显示，ASPS对白痢仔猪大肠杆菌的MIC为160 mg/mL，640 mg/mL ASPS对大肠杆菌的抑菌效果最明显。

2.2刺五加多糖与氧氟沙星对大肠杆菌的抑菌效果比较以抑菌圈的有无及直径大小为ASPS抑菌效果的测定指标，ASPS对白痢仔猪大肠杆菌的抑菌效果见表2。

表2 刺五加多糖与氧氟沙星对大肠杆菌的抑菌直径（mm）Table2 Inhibitory diameter of Acanthopanax senticosus polysaccharide and levofloxacin on fecal escherichia coli

在有抑菌作用的160、320和640 mg/mL ASPS中，640 mg/mL ASPS对大肠杆菌的抑菌直径最大，160 mg/mL ASPS对大肠杆菌的抑菌直径最小，其抑菌效果随着多糖浓度的升高而增强，即多糖浓度与抑菌效果呈正相关。

左氧氟沙星对大肠杆菌有较强的抑菌效果，160、320和640 mg/mL ASPS对白痢仔猪粪便大肠杆菌抑菌直径与左氧氟沙星的抑菌直径相比差异均不显著（P＞0.05），但640 mg/mL ASPS的抑菌直径比160和320 mg/mL ASPS的抑菌直径显著增加（P＜0.05）。将不同浓度的ASPS与1 mg/mL氧氟沙星的抑菌效果进行比较，氧氟沙星的抑菌效果显著高于不同浓度的ASPS的抑菌效果（P＜0.05）。160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌效果分别为氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%，说明ASPS的抑菌效果虽不及氧氟沙星，但也具有较为明显的抑菌效果。

3 讨论

多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物大分子[6]。本试验中使用的ASPS是采用水提醇沉法从刺五加根中提取的活性物质，该法能最大程度的保护ASPS结构的完整性和活性。以往的研究表明，ASPS是具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种生物活性的刺五加水提物[7]；同时，很多研究也已经表明刺五加水提物能调节畜禽肠道内的微生物的种群和数量。如刺五加水提物能增加断奶仔猪肠道乳酸杆菌、双歧杆菌等有益微生物数量，减少大肠杆菌等有害微生物数量[8]；还能促进犊牛消化道内乳酸杆菌的繁殖[9]；饲料添加800 mg/kg ASPS能显著提高断奶仔猪粪便乳酸杆菌数量，降低大肠杆菌数量，对免疫应激仔猪粪便的上述菌株也具有相似的影响效果[10]。有报道指出，多糖调节动物体肠道内微生物种群的作用可能与其作为有益菌的生长的底物促进乳酸杆菌生长，从而竞争性抑制大肠杆菌的增殖，进而改善仔猪肠道微生态平衡的有关[11]。

本试验对ASPS在体外对白痢仔猪粪便大肠杆菌的抑菌效果进行了研究发现，ASPS对白痢仔猪粪便大肠杆菌有一定的抑制作用，当ASPS浓度为160 mg/mL即有抑菌功能，当浓度升高至640 mg/mL时抑菌效果最好。与氧氟沙星的抑菌效果比较发现，640 mg/mL ASPS的抑菌功能约为氧氟沙星的1/2.9。刺五加是我国传统中草药，具有安全、无毒副作用的特点，与作为抗生素的氧氟沙星相比，在畜禽生产中使用对人体无毒副作用，不存在细菌耐药性等问题，本研究为ASPS在畜禽生产中预防和治疗仔猪白痢提供了试验依据。

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2016年《现代畜牧兽医》杂志征订启事

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Research on bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease

Han Jie1,Zhou Zilin1,Xu Renji2*
(1.College of Animal Science&Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 2.National Centre of Environmental Monitoring,Beijing 100012.)

Bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide(ASPS)on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease was examined by filter experiment method.The results showed that there were certain inhibitory effect on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease by ASPS with the most obvious bacteriostatic efficacy of 640 mg/mL ASPS and minimum inhibitory concentration of 160 mg/mL ASPS.The bacteriostatic ability of ASPS dose in 160,320 and 640 mg/mL of were 30.65%,32.26%and 35.28%respectively compared with levofloxacin.

Acanthopanax senticosus polysaccharide;Piglet;Escherichia coli;Antimicrobial activity

S828.5 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：B

B

1672-9692(2016)05-0005-04

2016-03-17

韩杰（1978-），女，讲师，博士，研究方向为动物生理的营养调控。

许仁骥（1978-），副研究员，主要从事环境污染的生物调控研究。

2014辽宁省博士科研启动基金计划项目（20141061）。