沼液处理液养殖普通小球藻的试验研究

乔 慧， 陈 灏， 赵玉柱

(1.中科院生态环境研究中心 鄂尔多斯固体废弃物资源化工程技术研究所， 内蒙古 鄂尔多斯 017100； 2.鄂尔多斯市城市矿产研究开发有限责任公司， 内蒙古 鄂尔多斯 017100)

沼液处理液养殖普通小球藻的试验研究

乔 慧1, 2， 陈 灏1, 2， 赵玉柱1, 2

(1.中科院生态环境研究中心 鄂尔多斯固体废弃物资源化工程技术研究所， 内蒙古 鄂尔多斯 017100； 2.鄂尔多斯市城市矿产研究开发有限责任公司， 内蒙古 鄂尔多斯 017100)

试验利用沼液处理液养殖目标藻种普通小球藻(Chlorellavulgaris)，考查普通小球藻的生长状况和其对沼液中总氮、氨氮、总磷和COD等主要污染物的去除情况。结果表明：沼液经梯度处理后普通小球藻总体生长情况逐渐增强，依次为：沉淀上清液<沼液沉淀-混凝出水液<沼液沉淀-混凝-吸附出水液。沼液处理液能有效促进藻体叶绿素的积累，总脂积累情况介于6.94%～23.82%之间。对沼液的净化效果，沼液处理液稀释组中沼液吸附出水稀释液(X-W)25%组的表现最好，总氮、氨氮、总磷和COD去除率分别为80.32%，83.88%，93.90%和20.00%，沼液处理液与BG11培养基的调配液组中表现最好的是沼液吸附出水调配液(X-B)10%组，去除率分别为88.37%，93.57%，97.40%和22.05%。试验的研究将为沼液的资源化处理提供理论依据。

普通小球藻； 沼液； 混凝； 吸附； 去除率

随着各类大中型沼气工程的建设，实现了将多种废弃物转化为清洁能源沼气和有机肥料，同时改善了生态环境，是进行生态环境重建的重要举措。然而，发酵产物沼渣沼液的妥善消纳却逐渐成为限制其发展的瓶颈问题[1]。沼液产生量大，全部就地消纳存在难度，若随意排放，不仅会导致氮、磷等营养物质流失，而且会引起水体的富营养化[2]。因此，沼液的资源化处理是一个亟需解决的问题。目前，沼液的资源化利用一般包括制作沼肥或饲料、农作物浸种或作杀虫剂、作调节剂或吸附剂以及培养微藻等方式[3]。

利用沼液培养微藻是一项具有多重效益的技术，藻体生长会消耗沼液中的氮、磷等营养成分和有机物，实现沼液的净化，是一种低成本的水处理技术； 同时沼液中的营养物质可满足微藻的基本需求，收获的藻细胞可用于开发饲料或作为添加剂，而且随着能源危机和环境问题的日益加剧，以微藻为原料进行生物燃料的生产也受到了广泛关注[4]，实现与提取生物质能源方面的耦合，降低了藻类养殖的成本[5]。小球藻作为常见藻种具有环境适应能力强、生长周期短、生物质能含量高、养殖过程可以实现规模化培养等特点[6]。迄今为止，国内外在利用藻类处理生活污水以及各种工业废水方面已进行了大量研究，并取得了显著成效[7-9]，利用普通小球藻净化厌氧发酵沼液的报道却较少。

因此，试验选择普通小球藻(Chlorellavulgaris)为目标藻种，研究沼液梯度处理的稀释液及其与BG11培养基调配液对普通小球藻生长的影响，观察受试对象的生长情况和藻体的品质，同时分析其对沼液中有机物的吸收、降解作用，为实现沼液的达标排放做基础研究，并在某种程度上实现沼液的资源化处理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 藻种来源

藻种：普通小球藻(Chlorellavulgaris，FACB-8)，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。

1.1.2 沼液及预处理

供试沼液采自鄂尔多斯市沙圪堵村镇有机固体废弃物综合处理厂。沼液中虽然含有适合普通小球藻生长的基本营养成分，但其浊度和pH值较高，对藻体的生长产生不利影响[10]。因此对供试沼液经充分自然沉降后取上清液进行沼液梯度处理，处理工艺采用“自然沉降-混凝-吸附”的梯度处理[11]，沼液及处理液的常规指标见表1。

表1 沼液处理液的常规指标

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D型超净工作台，PQX-300型人工气候箱，HJ-6S型六联搅拌器，T6新世纪紫外可见分光光度计，PHS-25C型pH计，SHZ-82型数显气浴恒温振荡器等。

1.3 试验分组

(1)CK组：蒸馏水作培养液。

(2)BG11组，BG11培养基配方，每1 L培养基中含有：1.5 g NaNO3，0.04 g K2HPO4，0.075 g MgSO4·7H2O，0.036 g CaCl2·2H2O，0.006 g柠檬酸，0.006 g柠檬酸铁铵，0.001 g EDTANa2，0.02 g Na2CO3，1 mL A5微量元素溶液，调节pH值为7.0，121℃灭菌30 min。

A5微量元素溶液：每1 L溶液中含有2.86 g H3BO3，1.86 g MnCl2·4H2O，0.22 g ZnSO4·7H2O，0.39 g Na2MoO4·2H2O，0.08 g CuSO4·5H2O，0.05 g Co(NO3)2·6H2O。

(3)沼液处理液包括充分自然沉降的沼液(Z)，沼液混凝出水液(H)和沼液吸附出水液(X)。

沼液处理液的蒸馏水稀释液(分别缩写为Z-W，H-W，X-W)，稀释比例为2%, 5%, 10%, 25%和50%，共15组。

沼液处理液与BG11培养基混合来培养微藻，不仅可以达到稀释沼液的目的，而且能保证营养元素的种类完备[12]。因此，另外添加沼液处理液与BG11培养基的调配液(Z-B，H-B，X-B)，调配比例为2%，5%，10%，25%和50%，共15组。

综上，共有普通小球藻实验组32组，每组300 mL，另设置平行一组，并进行高压蒸汽灭菌，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 藻种接种与培养

获取藻种后，将藻种在无菌条件下进行活化与扩培。取活化好的藻种接种于已灭菌的培养液中，接种50 mL(约15%接种量)，在恒温光照培养箱中培养。培养条件：温度28℃，光照强度4000 lux，昼夜比12 h/12 h。每日光照期间摇瓶3～4次，并随机调整位置，保证光照均匀。

1.4.2 观测分析

(1)藻类指标观测：通过测定光密度值OD680，绘制普通小球藻的生长曲线； 试验结束后通过离心取沉淀，洗涤烘干恒重，测定干重[10]，以此来衡量藻体生物量。

培养结束后藻液高速离心并洗涤获得藻泥，提取测定叶绿素含量[11](三色法)，藻泥在80℃烘干至恒重获得干藻粉，测定总脂含量[13](氯仿-甲醇共溶剂提取重量法)。

(2)培养液指标观测：将培养液10000 r·min-1离心5 min，取上清液用于水质分析，分别测定培养液中总氮(参照HJ 636-2012)，氨氮(参照HJ 535-2009)，总磷(参照GB 11893-89)和COD(参照HJ/T 399-2007)含量。

2 结果与分析

2.1 普通小球藻生长状况

2.1.1 普通小球藻的生长曲线

在波长680 nm下测定普通小球藻培养液的光密度值，为校正培养液对光的吸收，扣除高速离心(10000 r·min-1，10 min)后上清液在680 nm下的吸光度值。

图1 普通小球藻Z-W试验组的生长曲线

图2 普通小球藻 Z-B试验组的生长曲线

由图1～图6可知，CK和BG11在接种后5 d内处于调整期，随后进入对数生长，分别在29 d和33 d时达到最大值0.812和1.595。CK中藻种带入一部分营养物质供普通小球藻生长，在29天后营养物质供应不足，由稳定期进入衰亡期。BG11培养液中营养物质供应充足，因此，BG11的OD680始终高于CK。

由图1和图2沼液原液试验可知，试验初期由于不适应培养液，藻细胞出现死亡现象，OD680明显下降，Z-W 50%和Z-B 50%由于沼液浊度、色度较高，不利于光的透过，影响光合作用[10]，藻细胞全部衰亡。随沼液所占比例降低，抑制作用减轻，其中Z-W 2%在25 d达到最大，但仅为0.328。随BG11比例增大，营养物质供应充足，抑制作用减弱，Z-B 2%在31 d达最大值1.193，大于CK，小于BG11。

由图3和图4沼液混凝出水试验可知，与沼液原液试验组相似，试验初期藻细胞出现死亡现象，其中H-W 25%，H-W 50%，H-B 50%到试验结束均维持在0.1左右。同样，随沼液混凝出水比例降低，抑制作用减弱，H-W 5%在21 d达最大值0.438。H-B 2%和H-B 5%分别在29 d和33 d超过CK，其中H-B 2%从第11d开始出现持续生长，在试验结束时达到最大值1.440，略小于BG11。

图3 普通小球藻H-W试验组的生长曲线

图4 普通小球藻H-B试验组的生长曲线

图5 普通小球藻X-W试验组的生长曲线

图6 普通小球藻X-B试验组的生长曲线

由图5和图6沼液吸附出水试验可知，经过5 d左右调整期后，普通小球藻开始进入对数生长期，OD680不断升高，X-W 2%，X-W 5%，X-W 10%在试验结束时由稳定期进入衰亡期，生物量减少。X-W 25%在结束时仍在上升，达到最大值1.284。X-B试验组在结束时均大于CK组，其中X-B 2%，X-B 5%，X-B 10%在试验结束时大于BG11。

综上，从沼液梯度处理角度来看，总体长势随沼液原液、混凝出水液、吸附出水液逐渐增强； 从沼液处理液的稀释角度来看，3种处理液中生长状况最好的分别为Z-W 2%，H-W 5%和X-W 25%，说明随沼液梯度处理，沼液原液的抑制作用减弱，营养物质更易吸收； 从沼液处理液与BG11调配液角度来看，除了X-B 2%，X-B 5%，X-B 10%，随沼液处理液在培养液中所占比例增加，普通小球藻生长能力降低。为试验能显示出典型性，选择各处理中生长状况较好的试验组进行后续数据处理，即CK，BG11，Z-W 2%，H-W 5%，X-W 25%，Z-B 2%，H-B 2%和X-B 10%，共8组。

2.1.2 普通小球藻的生物量

光密度法和干重法都可以用来表示普通小球藻的生物量，它们之间存在一定的关系，在试验结束时对普通小球藻的生物量进行测定，测定结果见图7。

将普通小球藻干重与OD680之间进行线性关系拟合，可得拟合方程y=0.4708x+0.0978，相关系数R2=0.9871。说明普通小球藻OD680和干重之间存在良好的线性关系，即可用OD680来表征普通小球藻的生物量。

图7 普通小球藻的生物量

图8 普通小球藻叶绿素含量

图9 普通小球藻叶总脂含量

2.2 普通小球藻藻体基本指标

在试验结束后测定培养液中普通小球藻叶绿素含量和总脂含量，结果见图8和图9。

叶绿素是最主要的光合色素, 其含量在某种程度上反应着藻体生物量的大小[14]，各试验组叶绿素含量见图8和图9。由图可知，除了Z-W 2%和H-W 5%，其他试验组叶绿素含量均高于CK和BG11，说明利用沼液处理液培养普通小球藻能有效促进叶绿素的积累，这可能与沼液中含有一定量的氨基酸有关[15]。叶绿素含量最高的是X-B 10%组3.01 mg·L-1，表明吸附出水液的色度低、透光性好，光合作用能力强。此外，比较各试验组的叶绿素a和叶绿素b含量，叶绿素a/叶绿素b 介于1.063～1.644，均大于1，说明普通小球藻主要依靠叶绿素a进行光合作用。

微藻在对沼液中氮磷等营养物质吸收利用的同时，还可为能源微藻生产油脂提供丰富廉价的营养与水资源[13]，作为可再生能源生物柴油的原料，解决能源危机和环境问题。由图4可知，各试验组总脂积累情况表现为X-B 10%最高，占干重的23.82%，H-B 2%次之为19.56%，Z-W 2%最低为6.94%。

图10 普通小球藻对沼液的总氮去除率效果图

图11 普通小球藻对沼液的氨氮去除率效果图

图12 普通小球藻对沼液的总磷去除率效果图

图13 普通小球藻对沼液的COD去除率效果图

2.3 普通小球藻对沼液的净化效果

微藻对沼液中氮化合物的去除主要是通过其吸收作用，将含氮化合物通过自养作用合成藻细胞中氨基酸以及蛋白质等物质[10]。由图10可知，总氮去除效果明显。CK中含有少量藻种带入的氮源，但含量较低，在试验结束时总氮去除率达83.07%，BG11的初始总氮含量为319.51 g·L-1，随藻体大量生长消耗较大的氮，去除强度为278.46 mg·L-1。总氮的降解率与普通小球藻的生物量相一致，说明普通小球藻的生长能有效降解总氮。

微藻对培养液中氨氮的去除方式有两种，一是藻类的生长吸收消耗的易吸收氮源主要是氨氮，用于合成自身细胞所需的有机物； 二是微藻光合作用时，使溶液中pH值升高，从而导致氨氮的挥发[16]。由图11可知，氨氮去除率总体上略高于总氮。由于BG11培养基中氨氮含量很小，而普通小球藻在生长过程不形成氨氮，CK和BG11氨氮去除率分别为92.47%和94.36%。X-W 25%和X-B 10%初始氨氮含量为别为203.37 mg·L-1和82.38 mg·L-1，氨氮含量均较高，但普通小球藻仍可以较好生长，说明普通小球藻对高浓度氨氮的培养液具有较好的处理效果。

微藻对磷的去除也包括两种方式：一是微藻生长同化培养液中磷元素，合成自身的营养物质； 二是藻的光合作用使溶液中pH 值上升，磷元素以难溶盐的形式沉淀下来[16]。由图12可知，培养液中总磷含量介于1.47～12.38 mg·L-1，普通小球藻对总磷的去除效果明显，均大于80%。去除率最高的是X-B 10% 97.40%，去除强度为12.06 mg·L-1。CK，Z-W 2%和H-W 5%在试验后期普通小球藻进入衰亡期，藻细胞开始裂解，释放出磷元素，因此总磷去除率相对降低。

微藻对培养液中COD的去除主要是在光照不足或者无机碳源供应不足的情况下，利用培养液中的有机化合物充当碳源进行异样培养。由图13可知，普通小球藻对COD的净化效果不明显，说明普通小球藻在生长中利用的碳源主要是空气和沼液中的无机碳源，部分有机碳源可能吸附在藻的细胞表面而被脱除[17]。同样，CK，Z-W 2%和H-W 5%在试验结束时藻细胞分解增加了水质中的COD含量。COD降解率最高的是BG11为25.09%，X-B 10%次之为22.05%。

因此，综合考虑对沼液的净化效果，沼液处理液稀释组中X-W 25%表现最好，总氮、氨氮、总磷和COD去除率分别为80.32%，83.88%，93.90%和20.00%，沼液处理液与BG11调配液组中表现最好的是X-B 10%，去除率分别为88.37 %，93.57%，97.40%和22.05%。

3 结论

普通小球藻在沼液梯度处理液中总体长势随沼液原液、混凝处理液、吸附处理液逐渐增强。从沼液处理液稀释液角度来看，Z-W 2%，H-W 5%，X-W 25%长势较好，说明随沼液梯度处理，原沼液中的抑制物质减弱，营养物质更易吸收； 从沼液处理液与BG11调配液角度来看，Z-B 2%，H-B 2%，X-B 10%长势较好。沼液处理液能有效促进藻体叶绿素的积累，总脂积累情况介于6.94%～23.82%之间。

普通小球藻能有效降解培养液中总氮，总氮去除效果明显，降解率与普通小球藻的生物量相一致； 氨氮去除率总体上略高于总氮，且在氨氮含量较高的培养液中仍可以较好生长； 总磷的去除效果明显，均大于80%； COD的净化效果不明显，介于7.45%～25.09%之间，其中CK，Z-W 2%，H-W 5%在试验后期进入衰亡期，藻细胞裂解，增加了培养液中的磷含量和COD含量，因此去除率相对较低。

综合考虑普通小球藻的生长情况和品质指标，认为沼液处理液稀释组中X-W 25%和沼液处理液与BG11调配液组中X-B 10%作为培养液时，最适宜用作藻类培养液，此时可以得到较高的生物量，且藻体的叶绿素含量和总脂含量均较高，对沼液中的氮磷等营养物也有良好的去除效果。

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Chlorella vulgaris Cultivation with Treated Biogas Slurry /

QIAO Hui1, 2，CHEN Hao1, 2，ZHAO Yu-zhu1, 2/

(1. Ordos Institute of Solid Waste Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Science, Ordos 017100, China; 2. Ordos Urban Mining Research and Development Co Ltd, Ordos 017100, China)

The culture of target algaeChlorellavulgarisusing treated biogas slurry was carried out. The growth ofChlorellavulgaris, the removal rate of total nitrogen, ammonia nitrogen, total phosphorus and COD in the biogas slurry were detected. The results showed that the overall growth ofChlorellavulgariswas improved gradually with slurry gradient treatment level increased, which were in the order of sedimentation treatment

Chlorellavulgaris； biogas slurry； coagulation； adsorption； removal rate

2015-11-16

项目来源： “十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAC25B03)

乔 慧(1987-)，女，内蒙古包头市人，研究方向为沼液处理及资源化利用，E-mail:qiaohui9163@163.com

S216.4; X703

B

1000-1166(2016)06-0115-06