小梁切除术联合丝裂霉素C与羊膜植入对犬青光眼的治疗试验

董 俊，王少伟，宋 鸽，丁明星

(华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070)

小梁切除术联合丝裂霉素C与羊膜植入对犬青光眼的治疗试验

董 俊△，王少伟△，宋 鸽，丁明星*

(华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070)

探讨丝裂霉素C和羊膜植入在犬青光眼小梁切除术中的临床效果。成功建立12只(24只眼)犬的青光眼模型，随机分为4组(每组6只眼，每只犬双眼行不同手术)，即单纯小梁切除组(CT组)，行普通小梁切除术；丝裂霉素C组(MMC组)，行小梁切除术联用丝裂霉素C；羊膜组(AM组)，行小梁切除术联用羊膜植入；羊膜联合丝裂霉素C组(AM+MMC组)，行小梁切除术联用丝裂霉素C和羊膜植入。以术后眼压、滤过泡、并发症及纤维组织增生为指标，评价青光眼的治疗效果。结果显示，小梁切除术联用丝裂霉素C和羊膜植入在降低眼压、提高滤过功能、减少并发症和瘢痕形成等方面的效果优于其他组。

犬青光眼；小梁切除；丝裂霉素C；羊膜

青光眼是犬重要眼病之一，不及时治疗最终会导致失明。目前犬用于青光眼的手术方法有限，且治疗效果不明确。小梁切除术是治疗犬青光眼的常用手术方法之一，但该手术常因滤过区组织纤维增生、瘢痕形成而失去降压功效。因此,如何术后抑制滤过区结缔组织增生对提高小梁切除术成功率有着重要意义。

研究表明，抗代谢药丝裂霉素C能强烈抑制成纤维细胞的增殖，与小梁切除术联用，可大大提高其成功率。但丝裂霉素C毒副作用较强，术后可导致早期滤过过强、浅前房及低眼压等并发症[1]。羊膜是一种良好的体内植入材料，具有抑制新生血管和瘢痕形成的功能，近年来已被广泛用于青光眼的治疗[2-3]。目前二者联合用于犬青光眼的治疗缺乏报道。本试验通过建立犬的青光眼模型，在小梁切除术基础上联合应用丝列霉素C和羊膜植入，并对其在维持眼内压、防止滤过区域组织纤维增生等方面进行了观察，以评价二者联合运用在治疗犬青光眼的临床疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 选择12只健康杂交犬，无眼部疾病及外伤，无其他病症。试验犬饲养和管理全部严格按照《实验动物的饲养和使用原则》的相关规章制度执行。

1.1.2 主要试剂和仪器 卡波姆940，美国诺誉化工有限公司产品；丝裂霉素C，浙江海正药业股份有限公司产品；LYL-II型裂隙灯显微镜，江西凤凰光学有限公司产品；TONOVET眼压计TV01型，芬兰iCare公司产品。

1.1.3 复方卡波姆配制和保存 将卡波姆940 配制成含3 g/L卡波姆和0.25 g/L地塞米松的复方卡波姆溶液，高压蒸汽灭菌。4℃冰箱中保存。

1.1.4 羊膜制备和保存 无菌操作下，取健康母犬(犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒Ⅰ型/Ⅱ型检测为阴性)剖腹产的新鲜胎盘，用含4 000 U/ mL 庆大霉素液冲洗后剥离羊膜，将其置于手术用纤维滤纸上，上皮面朝上剪成小块，放入无菌纯甘油中脱水，24 h后转移到另一无菌纯甘油中，4℃冰箱中保存。保存时间不超过4周。手术使用前需先用生理盐水冲洗掉甘油，再置于含4 000 U/mL 庆大霉素的生理盐水中复水30 min。

1.2 方法

1.2.1 麻醉与保定 所有犬只双侧眼睛进行试验，术前均禁食8 h和禁水2 h。麻醉前30 min按0.05 mg/kg皮下注射阿托品，全身麻醉用0.1 mL/kg犬眠宝肌肉注射。试验犬只采用侧卧保定，术眼朝上。眼睑局部消毒，10 g/L的利多卡因液滴眼行表面麻醉。

1.2.2 青光眼模型建立 健康犬饲喂适应1周后，采用复方卡波姆液建立高眼压模型。将1 mL注射器穿刺针由角膜缘斜刺入前房，吸出约0.1 mL～0.2 mL的房水，不出针并更换已抽取的等量的复方卡波姆液针管，缓慢注入并保持针尖位于眼睛正中心位置。完成后生理盐水冲洗术眼。造模后1周内，若犬眼压持续升高，并稳定保持高于25 mmHg，则建模成功。

1.2.2 试验分组与手术方法 根据不同手术方法，将试验犬分为4组：单纯小梁切除组(CT组)，行普通小梁切除术；丝裂霉素C组(MMC组)，行小梁切除术联用丝裂霉素C；羊膜组(AM组)，行小梁切除术联用羊膜植入；羊膜联合丝裂霉素C组(AM+MMC组)，行小梁切除术联用丝裂霉素C和羊膜植入。

1.2.2.1 单纯小梁切除组(CT组) 显微镜下，选取眼球12点钟方向为手术部位，作以角膜缘为基底的结膜瓣，作边长约3 mm厚约1/3～1/2巩膜的三角形浅层巩膜瓣，切除1 mm×2 mm小梁组织，并做相应的虹膜周边切除。缝合时用11/0的缝线在巩膜瓣的顶端缝合1针，再连续缝合球结膜及结膜下组织。

1.2.2.2 丝裂霉素C组(MMC组) 在CT组基础上，完成巩膜瓣制作后在其下放置浸有丝裂霉素C的棉片5 min。移除棉片并用大量生理盐水冲洗。

1.2.2.3 羊膜组(AM组) 在CT组基础上，切除小梁组织后，将复水羊膜以上皮面朝上平铺于浅层巩膜瓣下，于四个角用11/0缝线固定。

1.2.2.4 羊膜联合丝裂霉素C组(AM+MMC组) 在CT组基础上，联合运用丝裂霉素组和羊膜组试验方法。

术后，于结膜下注射地塞米松1 mg以及庆大霉素1万单位，术眼滴加复方硫酸新霉素滴眼液，每天3次，连用3 d。

1.2.3 试验观察 注射复方卡波姆液一周，建模成功的试验犬进行小梁切除手术。分别于注射复方卡波姆溶液前(0 d)、小梁手术前(7 d)以及术后的每周同一时间(14 d、21 d ……)进行眼内压测量和裂隙灯显微镜观察，记录各组术后恢复及并发症情况。63 d，对试验犬实施安乐死，常规手术摘除眼球。取结膜和角膜组织进行固定制作石蜡切片并进行HE染色，在光学显微镜下观察滤过区域组织修复情况，判断滤过通道是否开放。

滤过泡评分参考Perkins T W等[4]的评分方法：0分，没有形成可见的滤过泡；1分，结膜增厚，没有小囊；2分，出现小囊；3分，滤过泡大小为2 h～3 h；4分，滤过泡大小超过3 h。

1.2.4 统计学方法 试验数据眼压、滤过泡评分、成纤维细胞数均以平均值±标准差表示,采用SPSS 20.0统计软件进行分析统计，其中眼压以及成纤维细胞数采用单因素方差分析。组间眼压比较采用LSD法进行检验，滤过泡评分采用非参数检验Kruskal-Wallis方法进行组间差异检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术眼眼压

本试验测定了0 d～63 d的术眼眼压(图1)。在0 d，各组眼压均在正常范围(11.39 mmHg～23.64 mmHg)，无显著性差异(P>0.05)。7 d试验犬眼压显著升高，提示造模成功。14 d，CT、AM、MMC和AM+MMC组眼压显著降低，分别下降57%、64%、75%和66%。与0 d比，CT组在49 d～63 d和AM组在42 d～63 d均显著升高(P<0.05)；但MMC组在35 d～63 d和AM+MMC组在28 d～63 d无显著差异(P>0.05)。

AM组眼压14 d～35 d及MMC组在14 d～63 d时均显著低于CT组(P<0.05)。AM+MMC组在28 d时眼压与AM组差异不显著(P=0.065)，但在35 d～63 d时显著低于AM组(P<0.05)。AM+MMC组在d 14眼压显著高于MMC组(P<0.05)，而在21 d～56 d二组间无显著差异(P<0.05)。

“a～c”不同字母表示相同时间不同组间均值间差异显著(P<0.05);“*”同组与d 0时均值相比差异显著(P<0.05)

"a-c"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05); "*"Values compared with d 0 differ significantly(P<0.05)

图1 术眼眼压(平均值±标准差，N=6)

Fig.1 IOP of the operated eyes(Mean± SD，N=6)

2.2 术眼滤过泡评分

术眼在14 d均形成可见滤过泡，随后其评分逐渐降低(图2)。与14 d比，CT、AM、MMC和AM+MMC组滤过泡评分分别在35 d～63 d、49 d～63 d、42 d～63 d和49 d～63 d显著降低(P<0.05)。AM组滤过泡评分在35 d～42 d以及MMC组和AM+MMC组滤过泡评分在14 d～49 d显著高于CT组(P<0.05)。AM+MMC组滤过泡评分在14 d～56 d显著高于AM组(P<0.05)但与MMC组滤过泡评分差异不显著(P>0.05)。

2.3 术眼并发症

术后，CT组2眼出现角膜新生血管，AM组1眼出现前房浑浊，MMC组发生结膜伤口不愈合以及持续低眼压各1眼，分别占该组术眼的33.3%、16.6%和33.3%。AM+MMC组未出现任何术后并发症(表1)

2.4 术眼纤维组织增生

CT组以及AM组均形成较厚的纤维组织，滤过通道被纤维组织代替，失去了滤过作用(图3A、图3B)。MMC组的滤过通道保持开放，但巩膜瓣纤维退化(图3C)。AM+MMC组纤维组织增生，但其滤过通道仍保持一定程度开放(图3D)。AM组与CT组的结膜下成纤维细胞数差异不显著(P>0.05)，

MMC组和AM+MMC组结膜下成纤维细胞数显著低于CT组和AM组(P<0.05)，但AM+MMC组与MMC组差异不显著(P>0.05)(图4)。

“a～c”不同字母表示相同时间不同组间均值间差异显著(P<0.05);“*”同组与d 0时均值相比差异显著(P<0.05)

"a-c"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05); "*"Values compared with d 0 differ significantly(P<0.05)

图2 术眼滤过泡评分(平均值±标准差，n=6)

Fig.2 Filtering bleb scores of the operated eyes(Mean± SD，n=6)

表1 术眼并发症情况(n=6)

Table 1 Complications of the eyes after surgery(n=6)

组别Groups新生血管Neovascularization结膜不愈合Non-healingconjunctiva持续低眼压Persistentocularhypotony前房炎症Anteriorchamberinflammation总计/%TotalCT组CTgroup20002(33.3)AM组AMgroup00011(16.6)MCC组MMCgroup01102(33.3)AM+MMC组AM+MMCgroup00000(0)

注：CT组：通小梁切除组； AM组：羊膜组；MMC组：丝裂霉素C组；AM+MMC组：羊膜联合丝裂霉素C组。

Note:CT group:common trabeculectomy； AM group:trabeculectomy combined with amniotic membrane；MMC group:trabeculectomy combined with mitomycin C ；AM + MMC group:trabeculectomy combined with mitomycin C and amniotic membrane.

3 讨论

临床上犬的原发性青光眼来源有限，需通过建立青光眼模型来进行研究。本试验参考复方卡波姆诱导兔的青光眼模型来诱导建立犬的青光眼模型[5-6]。复方卡波姆液中卡波姆可阻塞前房角房水的流出通道，地塞米松则减少了前房炎症的发生。在本研究的预试验中，应用复方卡波姆于犬眼的前房注射，1周内眼压持续升高并形成持续性高眼压，维持时间超过两个月。这与唐由之等[7]建立兔高眼压模型试验结果相似。复方卡波姆诱导建立犬青光眼模型操作简便，可维持较长时间的高眼压，并发症少。

丝裂霉素C是一种抗代谢药物，可抑制DNA复制，对成纤维细胞有明显抑制作用[8]。但其毒副作用较强，用于小梁切除术，易引发并发症[9]。本试验通过比较术后眼压、滤过泡、并发症以及组织修复情况发现丝裂霉素C组及羊膜联合丝裂霉素C组术后眼压回升较慢，滤过区域组织纤维增生相对较少，手术后滤过泡维持时间也相对较长。这可能与丝裂霉素C能抑制纤维细胞增殖有关。本结果与刘是等[10]在人青光眼临床治疗的研究结果相似。试验中，丝裂霉素C组术后出现低眼压和结膜伤口处不愈合各1例，也验证了其可能与丝裂霉素C的细胞毒性有关，丝裂霉素C在抑制纤维组织增生的同时，血管内皮细胞的损伤引起了周围组织的缺血坏死。

羊膜具有较好的韧性，是一种良好的体内植入材料，且能分泌碱性成纤维生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF) 、角化细胞生长因子(KGF) 、表皮生长因子(EGF)、色素上皮细胞衍生因子(PEDF)等多种细胞因子，可促进上皮细胞的生长，减少纤维增生以及抑制新生血管形成[11]。本试验发现小梁切除术联用羊膜和丝裂霉素C的手术方法抑制了角膜新生血管的产生，减少了小梁切除术后术区组织的纤维增生，降低了手术滤过区域的愈合能力，防止巩膜瓣与其他组织之间的愈合，保持滤过通道长期畅通。这与Demir等[12]的临床应用结果类似。Chunkui Shao研究发现羊膜对内皮细胞具有特异性的抑制作用，羊膜释放的PEDF可能会影响角膜新生血管的产生[13]。本试验中普通小梁切除组2眼出现角膜新生血管，可能与手术过程中对角膜缘区域的损伤相关，而羊膜组角膜未出现这样的症状，可能与羊膜基底膜中PEDF的抑制作用有关。小梁切除术联合羊膜与丝裂霉素C组，可因羊膜的阻隔作用防止丝裂霉素C引起的眼压下降过快，抑制纤维组织增生，减轻丝裂霉素C的毒副作用，减少了并发症的产生。 可见，小梁切除术联用羊膜和丝裂霉素C对治疗犬的青光眼效果优于普通小梁切除术以及小梁切除术联合羊膜或丝裂霉素C。

A.CT组，B.AM组，C.MMC组，D.AM+MMC组A.CT group，B.AM group，C.MMC group，D.AM+MMC group

“a～b”不同字母表示相同时间不同组间均值间差异显著(P<0.05)

"a-b"Values with different letters within the same time point differ significantly(P<0.05)

图4 眼术部结膜下成纤维细胞数

Fig.4 The number of fibroblasts in the operated field of the eyes

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Efficacy of Trabeculectomy with Mitomycin C and Amniotic Membrane Implantation for Canine Glaucoma

DONG Jun,WANG Shao-wei,SONG Ge,DING Ming-xing

(CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

To probe into the efficacy of trabeculectomy with mitomycin C and amniotic membrane implantation for canine glaucoma,the models of glaucoma in 24 eyes of 12 dogs were successfully established.Dogs with artificially induced glaucoma were randomly divided into 4 treatment groups:common trabeculectomy (CT group),trabeculectomy combined with mitomycin C (MMC group),trabeculectomy combined with amniotic membrane (AM group),and trabeculectomy combined with mitomycin C and amniotic membrane (AM + MMC group),6 eyes per each treatment,and each dog in two eyes was asked to use different surgical methods.The postoperative intraocular pressure,filtering bleb,complication and fibrous tissue proliferation were taken as indexes to evaluate the treatment efficacy of glaucoma.The results showed that trabeculectomy with mitomycin C and amniotic membrane implantation was better than other groups in reducing the intraocular pressure,maintaining the function bleb long time,decreasing scarring and complication.

canine glaucoma; trabeculectomy; MMC; amniotic membrane

2016-05-10

武汉亚洲心脏病医院合作基金项目(720107-3147142)

董 俊(1992-)，女，湖北武汉人，硕士研究生，主要从事临床兽医学研究。王少伟(1987-)，男，河北保定人，硕士研究生，主要从事临床兽医学研究。△同等贡献作者，*通讯作者

S853.56

A

1007-5038(2016)12-0055-05