反相HPLC法对奈达铂原料及其制剂的含量和有关物质的测定

鲁 军, 矫 建, 牛玉娟

(大连市药品检验所，辽宁 大连 116021)

论 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.07

反相HPLC法对奈达铂原料及其制剂的含量和有关物质的测定

鲁 军, 矫 建, 牛玉娟

(大连市药品检验所，辽宁 大连 116021)

目的 探讨反相HPLC法测定奈达铂和注射用奈达铂的含量和有关物质的可行性。方法 反相HPLC法检测5批奈达铂，3个规格7批注射用奈达铂的专属性与耐受性、线性关系、检出限、定量限、重复性与稳定性以及样品含量和有关物质。色谱条件：特定品牌C18柱；流动相为辛烷磺酸钠溶液-乙腈，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长220 nm。结果 奈达铂浓度为0.025～4.00 mg/mL浓度范围内，与峰面积线性关系良好(相关系数r=0.9998), 检出限为0.05036 μg/mL，定量限为0.1259 μg/mL。结论 反相HPLC法方法简便，结果准确，适用于对奈达铂和注射用奈达铂的质量控制。

反相HPLC法；奈达铂和注射用奈达铂；含量测定

奈达铂(Nedaplatin)，又名顺式-乙醇酸-二氨合铂，分子式：C2H8N2O3Pt，分子量：303.18，是日本盐野义制药公司在20世纪80年代中期合成的第二代铂类抗肿瘤药物[1]，1995年6月在日本首次获准上市，作用机制与顺铂相同，与肿瘤细胞的DNA碱基结合，阻碍DNA复制而发挥其抗肿瘤效果[2]，临床用于治疗头颈部肿瘤、肺癌、食道癌、宫颈癌等[3-6]。由于顺铂有较为严重的肾毒性和胃肠道不良反应，因此在顺铂上市后的30年中，医学界一直在寻找比母体化合物顺铂更加高效低毒的新化合物，奈达铂作为新一代铂类制剂，其疗效与顺铂相当或更优，具有治疗指数高，肾毒性和胃肠道反应较低，使用方便，不需水化等优点[7]。奈达铂和注射用奈达铂现执行标准有4个(国家药品注册标准YBH20202005，YBH13822004，YBH06312005，YBH08642008)，均为国家食品药品监督管理局注册标准，4个标准中采用不同的HPLC法测定含量和有关物质，但这四个方法的专属性和适用性均不理想。本研究经过试验，重新确定色谱条件，满足了方法的专属性和适用性的要求，新方法重现性好，结果满意。

1 材料和方法

1.1 材 料

Waters 2695 HPLC仪，Waters 2996 DAD检测器，十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(资生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm，CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm)。辛烷磺酸钠、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯；奈达铂对照品(批号：100787-201502)由中国药品生物制品检定所提供。奈达铂5批(批号：20150701；20150801；20150802；01-150506；01-150507)，注射用奈达铂3个规格7批(10 mg批号：20150405；20151202；11-150101；20 mg批号：20151201；20150203；50 mg批号：20150901；20150604)，均由生产企业提供。

1.2 反相HPLC法色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(资生堂CAPCELL PAK C18 SG120 5 μm 4.6 mm×250 mm，CAPCELL PAK C18 MGⅡ 5 μm 4.6 mm×250 mm 或CAPCELL PAK C18 MGⅢ 5 μm 4.6 mm×250 mm)；以辛烷磺酸钠溶液(取辛烷磺酸钠0.856 g加水适量溶解，加磷酸0.5 mL用水稀释至1000 mL)-乙腈(91∶9)为流动相，流速为每分钟1.0 mL，柱温40 ℃；检测波长为220 nm。

1.3 反相HPLC法的方法学考察

1.3.1 专属性与耐用性考察

取奈达铂对照品10 mg，置5 mL容量瓶中，加过氧化氢溶液(1→100)0.1 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置10 min后，分别取20 μL注入3根不同的色谱柱中进行测定，色谱柱分别为CAPCELL PAK C18 SG120，CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ，CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ。再将上述溶液配成80%，100%，120%3个浓度，分别取20 μL注入上述3根不同的色谱柱进行测定回收率。

1.3.2 线性关系的考察

精密称取奈达铂对照品约100 mg置25 mL量瓶中，加水适量溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1，再精密量取对照品溶液1 12.5 mL、3.0 mL、1.2 mL、0.3 mL,分别置于50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液2～5，量取对照品溶液1～5各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)与对照品浓度(X, mg/mL)绘制标准曲线，计算回归方程。

1.3.3 检出限

精密称取奈达铂对照品10.11 mg，置100 mL量瓶中，加水适量溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置200 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液2 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成检测限浓度样品溶液，取20 μL注入液相色谱仪进行测定。

1.3.4 定量限

精密量取检测限项下的储备液5 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀,配成定量限浓度样品溶液，取20 μL注入液相色谱仪进行测定。

1.3.5 回收率试验

注射用奈达铂按企业提供的处方比例分别制备含奈达铂为法定处方量80%、100%和120%的样品，每个浓度的溶液配制3份。取20 μL注入液相色谱仪进行测定，分别计算回收率。

1.3.6 重复性与稳定性试验

精密称取批号为 20150701的奈达铂20.44、20.31、21.51、20.16、20.89、19.50 mg，分别置10 mL量瓶中，加水适量溶解并稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪进行重复性试验测定。再取第一个供试品溶液，经2、4、6和24 h后分别取20 μL注入液相色谱仪进行稳定性试验测定。

1.4 样品含量和有关物质测定

奈达铂：取供试品约100 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算奈达铂的有关物质和含量。

注射用奈达铂：取供试品10支的内容物，混匀，精密称取适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中含2 mg的溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的4.5倍，并以水为空白进行校正，按外标法计算奈达铂的有关物质和含量。

2 结 果

2.1 反相HPLC法的方法学考察

2.1.1 专属性与耐用性考察

图1中各图为同一瓶溶液在3根色谱柱上的专属性分离图谱，表1为耐用性测定结果。在此条件下，用DAD检测器分析主峰奈达铂的峰纯度，为单一物质。

图1 专属性图谱Fig 1 Specificity spectrumA:CAPCELL PAK C18 SG120；B: CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ；C：CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ

表1 耐用性测定结果(回收率)

2.1.2 线性关系的考察

回归方程为： Y=1E+07X+2.339×105,r=0.9998；奈达铂浓度在0.025～4.00 mg/mL范围内，与其峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 检出限

按S/N为3∶1计算，检出限为0.05036 μg/mL(约为有关物质限度值的0.2%)。

2.1.4 定量限

按S/N为10∶1计算，定量限为0.1259 μg/mL。

2.1.5 回收率试验

平均回收率为100.6%(RSD=0.15%，n=9)。

2.1.6 重复性试验

6份供试品测得的含量的RSD为0.90%；不同时间段的供试品溶液测定的峰面积的RSD为0.62%。

2.2 样品含量和有关物质测定

奈达铂： 5批样品测定的含量分别为标示量的99.9%，100.7%，99.3%，98.6%，100.1%；其有关物质的含量分别为0.2%，0.1%，0.1%，0.2%，0.8%。

注射用奈达铂：7样品测定的含量分别为标示量的100.1%，98.8%，98.9%，103.7%，100.8%，97.0%，100.0%；有关物质的含量分别为0.1%，0.1%，0.6%，0.2%，0.2%，0.2%，0.2%。

3 讨 论

3.1 色谱柱

在药物分析中高效液相色谱法用得非常普遍，而色谱柱的选择直接影响实验结果与药物的质量控制。不同C18色谱柱的保留行为千差万别，选择适宜的色谱柱对分析样品至关重要[8]。在方法验证中，曾使用其它几个品牌和类型的C18色谱柱，但主峰前沿或拖尾比较严重，与相邻杂质峰无法实现较好分离，就此问题与企业也进行过沟通，企业也认为在他们以往的标准中，奈达铂对色谱柱要求较高，这也是困扰他们的一大问题。本研究在方法建立过程中，针对主成分和各相关杂质极性较大，易与未键合的硅羟基作用而拖尾的特点，选择了具有独特包膜技术的资生堂色谱柱，分别使用3种型号色谱柱，均能较好地重现实验结果，而其它品牌的色谱柱则不适用。

3.2 温 度

对于高效液相色谱而言，温度是一个一直被忽视而又非常重要的因素。升高色谱分析的柱温,不仅可以加快分析速度,而且还可以提高分离效率、改善峰形、调节选择性、减少有机溶剂的使用，是一个非常有效而又十分经济适用的方法，与其它调节分离效果的方法相比，具有其独特的优势[9]。本试验中温度对检测结果影响较大，当温度低于35 ℃时，奈达铂主峰会分裂出一个肩峰，因此，检测时，色谱柱的温度不能低于40 ℃；高于40 ℃时，主峰出峰时间更集中，但难以回落到基线水平，所以明确规定色谱柱温度。

3.3 方 法

YBH20202005标准采用氨基柱，其他3个标准均采用常规C18柱，在实验中，我们先采用这4个标准中的方法进行方法验证，但专属性验证均未通过，现行标准的4个实验条件中奈达铂与降解杂质无法分开，不能保证含量测定和有关物质检验结果准确。而本文的方法更换了色谱柱和流动相系统，经验证，在专属性、准确性、精密度、检测限、定量限、线性、范围、耐用性等方面验证均取得满意结果，可以保证检验结果准确。

3.4 方法验证结果

对整个方法进行了验证，其中专属性和耐用性试验结果说明奈达铂在规定的色谱柱间有较好的耐用性，此色谱条件可以有效分离奈达铂和有关物质。重复性试验结果说明样品在24 h内稳定。

本次试验中新建立了有关物质和含量测定的检验方法，其专属性、准确性、重复性、检测限、定量限、线性、耐用性等方面均符合要求。尤其在专属性和耐用性方面，能将奈达铂的有关物质和主成分进行有效分离，真正达到有效控制产品质量的目的。

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数字的表达方式

数字的表达方式执行GB/T 15835-1995《出版物上数字用法的规定》。公历世纪、年代、年、月、日、时刻和计数、计量均用阿拉伯数字。数字≥4位数时，每三位一组，组间空1/4个汉字空，如：“51,200”应写成“51 200”。但序数词和年份、页数、部队番号、仪表型号、标准号不分节。百分数的范围和偏差，前一个数字的百分符号不能省略，如：5%～95%，不能写成5～95%；(31.8±0.6)%，不能写成31.8±0.6%。附带尺寸单位的数值相乘，按下列方式写成：4 cm×3 cm×5 cm，不能写成4×3×5 cm3。

Determination of the content and the related substances of Nedaplatin crude drug and its injection by RP-HPLC

LU Jun, JIAO Jian, NIU Yu-juan

(DalianInstituteforDrugControl,Dalian116021,China)

Objective To establish a RP-HPLC method for determination of contents of Nedaplatin and its related substances in Nedaplatin injection. Methods The RP-HPLC condition was consisted of a specific brand C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with a column temperature at 40 ℃, the mobile phase was octane sulfonic acid sodium solution (the right amount of 0.856 g octane sulfonic acid sodium dissolved by water, adding phosphate 0.5 mL diluted to 1000 mL)- acetonitrile (91∶9) ,with a flow rate of 1.0 mL/min and detection at 220 nm. Results Nedaplatin showed good linearity in the range of 0.025-4.000 mg/mL (r=0.9998). The limit of detection and quantitation was 0.05036 μg/mL and 0.1259 μg/mL respectively. Conclusion The RP-HPLC method would be simple and applicable for the quality control of Nedaplatin crude drug and its injection.

RP-HPLC; Nedaplatin crude drug and its injection; content determination

鲁 军(1973-)，男，辽宁大连人，副主任药师。E-mail：lujun-0731@163.com

R927.11

A

1671-7295(2016)06-0549-04

鲁军,矫建,牛玉娟.反相HPLC法对奈达铂原料及其制剂的含量和有关物质的测定[J].大连医科大学学报，2016,38(6)：549-552.

2016-09-19;

2016-11-07)