雨生红球藻对过度训练大鼠骨骼肌MAPK信号通道蛋白表达及抗氧化能力的影响

佟 强，曹建民，周海涛



雨生红球藻对过度训练大鼠骨骼肌MAPK信号通道蛋白表达及抗氧化能力的影响

佟 强1，曹建民2，周海涛3

目的：研究雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)对过度训练大鼠骨骼肌MAPK信号通道蛋白表达及抗氧化能力的影响。方法：以等量负荷有氧运动训练和大强度耐力训练大鼠为模型，50只SPF级Wistar 7周龄雄性大鼠为对象，随机分为安静对照组(C组)、有氧训练组(M组)、过度训练组(OM组)、过度训练+雨生红球藻组(HOM组)4组，每组12只(剔除不符合实验要求的大鼠)。每天灌胃(ig)给药1次，雨生红球藻干预组剂量为0.4 mg/kg，ig体积为5 mL/kg，其他组ig 等体积生理盐水。42 d力竭游泳训练后，采用Western Blot法测定各组大鼠骨骼肌丝裂素活化蛋白激酶信号系统(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的蛋白表达含量，分光光度法测定骨骼肌SOD活性及MDA含量。结果：有氧训练使M组大鼠力竭游泳时间较C组显著增加(P<0.05)；过度训练则使OM组大鼠力竭游泳时间显著低于C组(P<0.05)和M组(P<0.01)；而补充雨生红球藻可使HOM组大鼠的力竭游泳时间显著高于OM组(P<0.01)，与C组和M组相比则无显著性差异(P>0.05)。过度训练使OM组大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性显著低于其他各组(P<0.05)；而补充雨生红球藻则使HOM组大鼠SOD显著高于OM组(P<0.05)，保持在与C组和M组接近的水平(P>0.05)。过度训练使OM组大鼠骨骼肌丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量较C组和M组明显升高(P<0.01)；而补充雨生红球藻则使HOM组的MDA显著低于OM组(P<0.01)，且与C组和M组无显著性差异(P>0.05)。有氧训练使M组大鼠p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulatrd protein kinase，ERK)信号通路蛋白表达较C组显著升高(P<0.05)；而过度训练则使OM组大鼠p38 MAPK、ERK蛋白表达进一步升高，与C组相比有非常显著性差异(P<0.01)，与M组相比无显著性差异(P>0.05)；补充雨生红球藻使HOM组大鼠p38 MAPK、ERK蛋白表达显著低于OM组(P<0.05)，但高于C组(P<0.05)。结论：1)过度训练导致MAPK信号通路蛋白过度表达，氧化-抗氧化系统失衡，氧化应激反应加剧，对机体造成损伤；2)补充雨生红球藻可以抑制MAPK信号通路蛋白的过度表达，提高骨骼肌抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，调节机体的抗氧化能力，预防和延缓运动疲劳的发生与发展。

雨生红球藻；过度训练；丝裂素活化蛋白激酶；蛋白表达；抗氧化

体育运动中，运动员常需要进行长时间、大强度的运动训练刺激机体，以提高身体机能和运动成绩。过度训练(overtraining,OT) 指运动与运动能力、训练与恢复、应激与应激耐受的失衡状态，是运动负荷与机体机能间过分不相适应，以致疲劳连续累积，引起一系列功能紊乱和病理状态的一类常见运动性疾病。过度训练的出现与训练压力与机体恢复处于长期失衡状态有关，常发生在运动员接受过长时间或过大强度的运动训练后，由于训练负荷超过了身体的耐受程度和适应能力，导致在较长时间内(数周至数月)身体疲劳无法消除、运动能力无法恢复[9，11，14]。正常状态下，机体内自由基代谢保持动态平衡，不会造成伤害。但长时间、大强度运动中，由于组织耗氧量的大幅增加，引发自由基大量产生，同时对抗氧化剂及合成抗氧化酶的微量元素的需求和消耗明显增加，体内pH值、血浆渗透压等内环境及激素水平发生显著变化。在此过程中，如果机体抗氧化系统得不到有效恢复，将会使内环境中自由基的清除作用受到显著的不利影响，导致自由基在组织中过度堆积，引发脂质过氧化级联反应，使细胞膜结构和线粒体等细胞器受到破坏，影响细胞正常生理功能的发挥[3]。骨骼肌作为人体最直接参与运动的器官之一，是运动时最大的耗能与耗氧器官，也是易受自由基攻击损伤的主要器官[4]。运动训练对机体氧化应激的影响以及如何保护机体免受运动性氧化应激的不利影响是近年来相关领域的研究热点。有研究表明，丝裂素活化蛋白激酶信号系统(MAPK)在对环境应激的适应中及机体维持内环境氧化-抗氧化的动态平衡状态中具有重要作用。运动刺激能够激活骨骼肌细胞中的MAPK信号传导通路系统，不同的运动方案，不同收缩类型的肌肉，都可以影响到MAPKs信号通路的激活。过度训练刺激会造成机体严重氧亏，机体内此时所产生的ROS活性氧类物质会超出机体的清除能力范围，从而产生氧化应激反应。此时ROS是应激源，作为细胞信号分子，通过激活MAPK将细胞外此种刺激信号转导至胞核内，介导细胞产生特异性反应。虾青素属类胡萝卜素，是一种天然抗氧化剂，具有极强的抗氧化活性并可通过血脑屏障，能够有效清除细胞内的氧自由基，保护细胞和组织健康，在抑制炎症细胞因子、降低肌肉和肝肾损伤风险、改善心血管疾病等方面有积极作用。雨生红球藻是自然界中生产天然虾青素的最佳生物，虾青素含量为1.5%～10.0%。本文以等量负荷有氧运动训练和大强度耐力训练大鼠为模型，探讨补充雨生红球藻对过度训练大鼠骨骼肌MAPK信号转导系统诱导抗氧化酶基因表达的影响，及其对机体的抗氧化能力的调节作用，从而为其在体育科研和训练实践中的应用提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠50只，7周龄，平均体重245.2±13.7 g，北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号SCXK(京)2006-0008。在整个实验过程中，实验室内温度保持在22℃±2℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。所有实验大鼠均以基础饲料(北京大学医学部实验动物科学部提供)和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为49 d，正式训练时间为42 d。

1.2 药物与试剂

雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)购自陕西森弗天然制品有限公司。将雨生红球藻用匀质器粉碎后用无菌蒸馏水配制成所需浓度，4℃存放备用。p38抗体购自天德悦(北京)生物科技有限公司，批号20160107；细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulatrd protein kinase，ERK)抗体购自赛信通(上海)生物试剂有限公司，批号20160114；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号依次为20160115和20150113。

1.3 仪器

佳宝“AP1500”型水泵(广东振华电器有限公司)，5417R低温超速离心机(德国艾本德股份公司)，MultiSkan3酶标仪(芬兰雷勃公司)，PowerPac系列电泳仪(美国Bio-Rad公司)，电子组织匀浆器(美国KIMBLE公司)，NR-B17CC型超低温冰箱(日本松下电器产业株式会社)，ISO9001型电子天秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组

50只实验大鼠适应性饲养4 d后，以30 min/d的运动量对其进行为期3 d的筛选，淘汰2只不适应游泳训练的大鼠，将剩余大鼠以数字随机分组法分为安静对照组(C组)、有氧训练组(M组)、过度训练组(OM组)、过度训练+雨生红球藻组(HOM组)4组，每组12只。训练期间，各组每天自由摄食饮水，采用专业灌胃器，每天ig 1次。干预组灌胃(ig)剂量为4 g/kg/d的雨生红球藻，相当于成人推荐剂量30倍(中药药理实验中常采用人体剂量的5倍、10倍、30倍的剂量对大鼠进行干预，本研究通过前期预实验明确高剂量组效果最佳[1]。)，ig体积为5 mL/kg。其他组ig等体积生理盐水。

2.2 训练及测试方案

C组不进行任何运动；M组每天无负重游泳60 min；OM组及HOM组参照朱全等的过度训练模型[10]进行42 d递增负荷游泳运动。1～3周通过递增游泳时间来递增运动负荷(第1周：5～30 min，第2周30～60 min，第3周60～120 min)；4～6周固定运动时间增加负重(第4周负重1%～2%体重，第5周2%～4%体重，第6周4%～6%体重)。玻璃泳槽水深50 cm，水温31℃±2℃，在游泳箱底部放置水泵形成流动水防止大鼠在水面漂浮不动。每周6 d，休息1 d。按照上述训练方案完成6周训练后，C组和M组神态安静，时而活泼好动，皮毛光洁整齐，眼睛有神；OM组普遍神态倦怠，易受惊吓，皮毛脱落，体型瘦弱，双眼暗淡无光。结合运动后血液指标(表1)，确定了大鼠过度训练模型建立成功。

表 1 本研究训练结束后大鼠血清睾酮的变化一览表

注：与C组相比，a为P<0.05，有显著性差异；与M组相比，b为P<0.05，有显著性差异。

2.3 指标测定

各组大鼠于末次游泳训练后，2%的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉处取全血5 mL加入柠檬酸钠溶液抗凝，37 ℃水浴30 min后，4 ℃ 3 000 rpm离心10 min，分离制备血清，加测血清睾酮，评价大鼠过度训练模型的建立。迅速分离出大鼠两侧完整的深层腓肠肌，放入预冷的生理盐水中漂洗，除去血液及其他结缔组织，并用滤纸将其拭干，切取300 mg左右质量的腓肠肌，分为3份，每份约100 mg，用锡纸包好，标记并装入密封袋中，立即投入液氮中冻存，所取样品均放入-80℃超低温冰箱中保存，待测抗氧化酶的活性和MAPK信号通道蛋白表达的含量。分光光度法测定骨骼肌SOD活性及MDA含量，Western Blot法测定MAPK信号通道蛋白表达含量。所有指标的测试均按试剂盒的操作说明严格执行，计算公式等详见试剂盒使用说明书。

2.4 蛋白抽提

预冷RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制剂。在蛋白抽提开始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF终浓度1 mM，冰上保持低温。称取100 mg肌肉组织以重量∶裂解液体积=1∶9比例加入裂解液，15 000 rpm转速进行匀浆，每次10 s，间隔10 s，进行3次。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20 min，4 ℃离心，13 000 rpm，20 min。离心完成后取上清，分装保存，待测。2.5 蛋白浓度测试及调整

将BCA工作液A液∶B液=50∶1，充分混匀稀释后，各个提取BSA标准品。样品用PBS进行稀释。样品∶BCA工作液=1∶8，混匀后37 ℃孵育30 min或者室温孵育60 min，酶标仪570 nm波长滤光片读取OD值。以RIPA调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液后样品终浓度为4 mg/mL(不同样品具体确定)。煮沸变性5 min。腓肠肌浓度调为4 μg/μL。

2.6 Western Blot法测定各指标

根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。电泳条件：浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。湿转法转膜，转膜条件：300 mA恒流；0.45 um孔径NC膜，转膜时间1 h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。3%BSA-TBST室温封闭30 min后，用3% BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10 min，4℃过夜。p38一抗稀释比例为1∶2 000，ERK一抗稀释比例为1∶10 000。次日，4℃取出膜，在室温孵育30 min。TBST洗膜5次，每次3min。洗完后进行二抗孵育。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1∶10 000，室温轻摇40 min。TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光：10 s～5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。胶片洗净晾干后，用凝胶成像系统拍照，再用Quantity One软件去除背景后，分析条带光密度值，通过目标蛋白条带光密度值/β-actin条带光密度值，得到目标蛋白的相对含量。

2.7 数据统计

3 结果

3.1 对大鼠运动能力及骨骼肌SOD活性和MDA含量的影响

如表2所示，有氧训练使M组大鼠力竭游泳时间较C组显著增加(P<0.05)；过度训练则使OM组大鼠力竭游泳时间显著低于C组(P<0.05)和M组(P<0.01)；而补充雨生红球藻可使HOM组大鼠的力竭游泳时间显著高于OM组(P<0.01)，与C组和M组则无显著性差异(P>0.05)。过度训练使OM组大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性显著低于其他各组(P<0.05)；而补充雨生红球藻则使HOM组大鼠SOD显著高于OM组(P<0.05)，保持在与C组和M组接近的水平(P>0.05)。过度训练使OM组大鼠骨骼肌丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量较C组和M组明显升高(P<0.01)；而补充雨生红球藻则使HOM组大鼠的MDA显著低于OM组(P<0.01)，且与C组和M组无显著性差异(P>0.05)。

3.2 对大鼠骨骼肌p38 MAPK、ERK蛋白表达的影响

如表3、图1、图2所示，各组样本均检测出p38 MAPK、ERK 信号通路蛋白表达。有氧训练使M组大鼠p38 MAPK、ERK信号通路蛋白表达较C组显著升高(P<0.05)；而过度训练则使OM组大鼠p38 MAPK、ERK信号通路蛋白表达进一步升高，与C组相比有非常显著性差异(P<0.01)，与M组相比无显著性差异(P>0.05)；补充雨生红球藻使HOM组大鼠p38 MAPK、ERK信号通路蛋白表达显著低于OM组(P<0.05)，但高于C组(P<0.05)。

表 2 运动及雨生红球藻对大鼠运动能力及骨骼肌SOD活性和MDA含量的影响一览表

Table 2 Effects of Exercise and Lycium Ruthenicum Murr on Rats’Exercise Capacity,SOD Activity and the Content MDA in Skeletal Muscle

剂量(g/kg)力竭游泳时间(min)骨骼肌SOD(U/mg)骨骼肌MDA(nmol/mg)C组—84.9±13.3373.572±56.73723.895±7.414M组—104.7±14.31,4374.413±47.216323.115±6.9724OM组—71.3±13.11284.375±39.218140.114±8.6732HOM组0.4110.5±18.54340.235±41.436330.398±9.0534

注：与C组比较：1为P<0.05，2为P<0.01；与OM组比较：3为P<0.05，4为P<0.01；下同。

剂量(g/kg)p38MAPKERKC组—47.92±6.2659.51±5.39M组60.15±7.84165.41±7.061OM组—81.95±7.06285.26±7.172HOM组0.463.10±6.931,369.14±7.851,3

图 1 本研究各组大鼠p38 MAPK蛋白表达平均积分光密度值

Figure 1. The Average Optical Density ofp38MAPK Protein Expression in Groups

图 2 本研究各组大鼠ERK蛋白表达平均积分光密度值

Figure 2. The Average Optical Density ofERK Protein Expression in Groups

4 讨论

4.1 运动及雨生红球藻对大鼠抗运动疲劳能力的影响

力竭时间是评估机体抗运动疲劳能力的直接指标。有氧训练可提高机体对同等物理负荷刺激的适应能力及抗氧化能力，进而在一定程度上提高抗运动疲劳的能力[2]。其机制可能与有氧代谢酶及供能能力的提高有关，此外，还可能与抗氧化酶活性增强和阻断脂质过氧化链式反应有关[16]。当训练负荷过大、恢复时间不足时，则可能导致过度训练综合症[11,14]。在本研究中，OM组大鼠在6周递增负荷训练后受训练周期长、强度大、恢复时间短等因素的影响，抗氧化酶活性下降，自由基代谢紊乱，机体氧化-抗氧化系统失衡，氧化应激显著增加。而雨生红球藻灌胃干预则可使过度训练大鼠的抗运动疲劳能力明显增强，骨骼肌SOD活性提高，MDA降低。其可能机制为：雨生红球藻中的虾青素成分可有效提高骨骼肌组织中SOD活性，降低运动过程中大量产生的自由基对组织造成的脂质过氧化损害，保证了机体氧化-抗氧化系统的动态平衡，有效缓解了氧化应激反应的发生与发展，从而提高抗疲劳能力[13]。

4.2 运动及雨生红球藻对大鼠骨骼肌p38 MAPK、ERK1/2信号通路蛋白表达的影响

MAPK信号系统为大部分原核生物和所有真核生物所共有，由一组位于细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶构成，能被不同的细胞外刺激激活，是信号从细胞外传导到细胞核内的重要通路，能够介导多种细胞反应。MAPKs家族由ERK1/2、JNK、p38、ERK3/4、ERK5 5个亚类组成[7]，其中，p38和ERK是较为重要的两条通路，运动及氧化应激可对其产生重大的影响。p38信号通路是细胞信息传递的交汇点和共同通路，为维持细胞正常功能所不可或缺，可参与多种细胞内生理活动，如细胞生长发育、细胞间功能同步、调控炎症和应激反应、运动信号转导等。ERK 1/2信号通路是细胞增殖与分化过程中重要的信号转导途径，具有促进特定基因的转录与表达的作用，对于骨骼肌的生长具有重要作用[8]。

研究表明，正常情况下，机体内自由基代谢处于动态平衡状态。但运动过程中，尤其是长时间、大强度运动可导致机体氧化-抗氧化系统失衡，氧化应激加剧。超量的自由基会攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，通过自由基链式反应生成脂质过氧化物，产生细胞毒性，使细胞膜的流动性和通透性受到破坏，可使酶等带有氨基的蛋白质发生交联、丧失活性，并可使核酸和染色体受到破坏，从而破坏细胞的结构和功能，引发细胞死亡和组织损伤[8]。另一方面，自由基又可激活MAPKs等氧化还原敏感型信号通路，使氧化还原敏感型基因(如抗氧化酶基因等)的表达增强[7]，从而增加抗氧化酶的合成，提高细胞清除自由基的能力，减轻和阻断细胞的过氧化损伤[15,17]。MAPKs的激活及其时相可受到运动方式和肌肉类型的影响[8,17]。在进行运动训练时，肌肉的收缩活动显著增强，可使p38 MAPK信号通路受到激活，增强相关基因的表达，从而使p38蛋白合成增加[6]，p38激活程度与运动的负荷之间存在正相关关系。运动还可激活ERK1/2通路[6]，在骨形成、骨所受到的应力和病理性骨折以及牵引成骨手术治疗等过程中发挥重要的中心环节作用[12]。ERK可被过氧化氢等ROS激活，其主要机制是直接激活信号通路中上游的c-Raf-1，或通过抑制磷酸化间接影响P-ERK的含量。通过对抗氧化应激反应，直接或者间接阻断MAPK信号转导通路[8]。

本实验的结果表明，6周有氧训练可上调大鼠p38 MAPK、ERK信号通路的蛋白表达，这可能与运动导致的氧化应激对MAPK系统产生激活作用有关，有利于细胞产生预适应，阻断更严重的氧化应激的发生。而过度训练使机体的应激能力受到严峻考验，出现氧化-抗氧化系统失衡和能量代谢紊乱，自由基出现大量堆积并导致p38、ERK信号通路过度表达，造成细胞损伤。而营养干预组由于大量摄入富含抗氧化物虾青素的雨生红球藻，可有效提高骨骼肌中SOD等抗氧化酶的活性，提高肌细胞清除自由基的能力，抑制或延缓氧化应激的发生与发展，降低骨骼肌中的脂质过氧化级联反应，进而抑制p38和ERK1/2信号通路蛋白的过量表达。

5 结论

补充雨生红球藻可以有效缓解过度训练导致的机体内环境失衡，提高机体尤其是骨骼肌的氧自由基清除能力，抑制MAPK信号通路的蛋白表达，预防和延缓运动疲劳的发生与发展。

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Effects of Haematococcus Pluvialis on Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Pathways Protein Expression and Antioxidant Capacity in Overtraining Rat Skeletal Muscle

TONG Qiang1,CAO Jian-min2,ZHOU Hai-tao3

To analyze the effect of Haematococcus Pluvialis on the expression of MAPK signal channel protein and antioxidant capacity in skeletal muscle of rats with overtraining.Method:To establish equivalent load aerobic training and high intensity endurance training rats as a model,50 7-week-old male SPF Wistar rats were randomly divided into 4 groups,with 12 in each group (the rats that did not meet the requirements were removed) :control group (C Group ),aerobic training group (M group ),overtraining group (OM group ),overtraining and Haematococcus Pluvialis group (HOM group ).The dose of HOM group was 0.4 mg/kg,the volume was 5 ml/kg.Other groups was given equal volume of saline.After 42 days swimming training,mitogen activated protein kinase (MAPK) signal channel protein expression and antioxidant indicators (SOD and MDA) in skeletal muscle of rats were evaluated by western blot and spectrophotometry.Results:The exhaustive swimming time of M group was longer than C group (P>0.05 ),and that of HOM group was significantly longer than OM group (P<0.01).The SOD activity in M group was higher than that in C group (P>0.05);and that in OM group was significantly lower than C group and M group (P<0.05),and that in HOM group was significantly higher than OM group (P<0.05).The MDA content in M group was slightly lower than C group (P>0.05);that in OM group was significantly higher than C group and M group (P<0.01),that in HOM group was significantly lower than OM group (P<0.01).The expression of p38 MAPK and ERK signal channel protein in M group was higher than that in C group (P<0.05),and that in M group was lower than the OM group (P<0.05);that in OM group was higher than C group (P<0.01);that in LM group was higher than that in C group (P<0.05),and that in HOM group was lower than OM group (P<0.05).Conclusions:1) The overtraining leads to an excessive expression of MAPK signal channel protein,and an imbalance of oxidation and antioxidation system,causes oxidative stress and damage of the body.2) The supplementation of Haematococcus Pluvialisafter Murr.can inhibit the excessive expression of MAPK signal channel protein,and activate the MAPK signal channel so as to regulate the expression of antioxidant genes,and improve the capacity of scavenging oxygen free radical in skeletal muscle,and regulate the antioxidant capacity of body,and prevent and delay the occurrence and development of exercise fatigue.

HaematococcusPluvialis;overtraining;mitogen-activatedproteinkinase;proteinexpression;antioxidant

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1002-9826(2016)04-0133-06

10.16470/j.csst.201604017

2016-04-19；

2016-07-03

北京市朝阳区协同创新项目(CYXC1508)。

佟强(1970-)，男，辽宁鞍山人，副教授，博士，主要研究方向为运动训练， E-mail:tongqiang@jlu.edu.cn；曹建民(1961-)，男，河北安国人，教授，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动训练监控,E-mail:bsucaojianmin@aliyun.com；周海涛(1976-),男，辽宁海城人，副教授，硕士,主要研究方向为运动性疲劳与恢复，E-mail:zsettle@sina.com。

1.吉林大学 体育学院，吉林 长春，130012；2.北京体育大学，北京100084；3.北京联合大学 生物化学工程学院，北京 100023 1.Jilin University,Changchun 130012,China;2.Beijing Sport Universty,Beijing 100084,China;3.Beijing Union University,Beijing 100023,China.

G804.2

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