培育蝉花改善小鼠睡眠功能的试验研究

张忠亮，王玉芹，樊美珍

(1.浙江泛亚生物医药股份有限公司，浙江 嘉兴 314200; 2. 浙江泛亚生命科学研究院，浙江 嘉兴 314200)



培育蝉花改善小鼠睡眠功能的试验研究

张忠亮1,2，王玉芹1,2，樊美珍1,2

(1.浙江泛亚生物医药股份有限公司，浙江 嘉兴 314200; 2. 浙江泛亚生命科学研究院，浙江 嘉兴 314200)

观察不同剂量的人工培养蝉花子实体及菌丝体对小鼠睡眠的改善作用，健康昆明小鼠，随机分成8组，每组10只.每天经口灌胃给予不同剂量的人工培养蝉花子实体及蝉花菌丝体，连续给予受试物30 d后进行直接睡眠作用试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏实验测定小鼠直接睡眠时间、戊巴比妥钠诱导的睡眠时间及阈下剂量的睡眠发生率、巴比妥钠诱导的睡眠潜伏时间.结果表明，与空白对照组比较人工培养蝉花子实体300 mg/kg、900mg/kg及菌丝体900 mg/kg对阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠一定的促进作用(P<0.05)，且没有明显的剂量依赖关系；与空白对照比较，300 mg/kg人工培养蝉花子实体和900 mg/kg蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间有明显的延长作用，但不同剂量的两种受试药物对巴比妥钠睡眠潜伏期基本无影响，且均无直接至眠作用.人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对小鼠睡眠有一定的改善作用.

蝉花；虫草；子实体；菌丝体；睡眠

蝉花(Isaria cicadae)是一种传统的中药材，与冬虫夏草同属于虫草属，为麦角菌科大蝉草(Cordyceps cicadae Shing)寄生在蝉科昆虫山蝉、竹蝉、草蝉的若虫上形成的子座及若虫尸体的复合体.其药用功效始载于南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》，具有透疹、疏散风热、熄风止痉之功效.明代医药学家李时珍《本草纲目》中记载“功同蝉蜕，又止疟.”天然蝉花其药用部分是子座及寄主昆虫的尸体(菌核).随着自然环境的变化，蝉花失去了它应有的生长环境，加之过度釆挖等使得野生蝉花资源迅速减少，资源稀缺，也成为蝉花制剂走向世界的一大障碍.目前，在微生物学及分子生物学的指导下，在中药现代化的观念和现代的制药技术的基础上蝉花人工培育及规模化生产已经实现，弥补了野生资源不足的缺陷.

现代医学研究发现人工培养蝉花与野生蝉花有着相似的活性及营养成分，其中多种活性成分在体内脂质的运输与转化代谢[1]，降血糖[2]、抗感染[3]等方面作用明显.所以人工培养蝉花在医药学上的地位也开始被重视.然而，目前国内外对人工培养蝉花改善睡眠功能的研究尚未见报道.因此，本文主要采用建立戊巴比妥钠睡眠等动物模型来研究人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对睡眠的改善作用，为其保健功能评价、促进蝉花虫草系列产品的开发提供进一步的科学依据，为进一步解释蝉花虫草的改善睡眠的机制提供科研数据.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

人工培养蝉花子实体(批号FY2012B05)和蝉花菌丝体(批号FY2012A02)，均由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；巴比妥钠，国药集团化学试剂公司，(批号：F20100126)；戊巴比妥钠，上海化学试剂公司进口分装，(批号：F20080915)；安神补脑液，吉林敖东延边药业股份有限公司出品，(批号：111015)；生理盐水(KB)，自配.

1.2 动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，购自安徽医科大学实验动物中心.

1.3 方法

1.3.1 小鼠直接睡眠实验

昆明种小鼠随机分为空白对照组、阳性药(安神补脑液5 mL/kg)组、人工培养蝉花子实体250、500、1 000 mg/kg 三个剂量组及蝉花菌丝体250、500、1 000 mg/kg三个剂量组，共8组，每组10只，雌雄各半.每天上午灌胃给药(ig，0.3 mL/10g体重)，连续30 d.观察末次给药(Am9:00 ～10:00)1 h内入睡小鼠数和睡眠持续时间，以翻正反射消失超过30 s为睡眠指标.

1.3.2 小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验

昆明种小鼠随机分为对照组、阳性药(安神补脑液5 mL/kg)组、人工培养蝉花子实体100、300、900 mg/kg 三个剂量组及蝉花菌丝体100、300、900 mg/kg三个剂量组，共8组，每组10只，雌雄各半.每天上午灌胃给药，连续30 d.末次给药2 h，小鼠腹腔注射(ip)阈下剂量戊巴比妥钠30 mg/kg(预试表明可使10 ～20%正常小鼠翻正反射消失)，观察记录各组入睡小鼠数(翻正反射消失达1 min以上者).

1.3.3 小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期实验

小鼠分组、给药同上.末次给药l h后，小鼠腹腔注射巴比妥钠(240 mg/kg，预试表明可100%使正常小鼠翻正反射消失)，观察各组小鼠巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期的变化.

1.3.4 延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间实验

小鼠分组、给药同上.末次给药l h后，小鼠腹腔戊巴比妥钠(60 mg/kg，预试表明可使正常小鼠翻正反射消失达100%)，观察小鼠戊巴比妥钠诱导的睡眠时间有无延长.

1.4 统计处理

计时实验资料(min)用方差分析，方差齐者，计算F值，不齐者，进行对数转化(lg min)后再进行方差分析，结果用表示.计数实验资料用X2检验.统计处理以P<0.05为有显著性差异.

2 结 果

2.1 对小鼠直接睡眠的影响

如表1 所示，各剂量人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对小鼠的直接睡眠均无明显作用.

组别剂量(/kg)n组别代码直接睡眠睡眠小鼠只数睡眠持续时间/min空白对照—10KB00.0±0.0安神补脑液5mL10YD00.0±0.0250mg10ZST10000.0±0.0蝉花子实体500mg10ZST30000.0±0.01000mg10ZST90000.0±0.0250mg10JS10000.0±0.0蝉花菌丝体500mg10JS30000.0±0.01000mg10JS90000.0±0.0

2.2 对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响

结果如表2所示，与空白对照组比较，300 mg/kg人工培养蝉花子实体组及900 mg/kg人工培养蝉花子实体组和蝉花菌丝体组的小鼠睡眠只数有明显的增加，见图1.提示人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠一定的促进作用.

组别剂量(/kg)组别代码n睡眠小鼠只数睡眠小鼠百分率/%空白对照—KB1000安神补脑液5mLYD106**60蝉花子实体100mgZST10010220300mgZST300105**50900mgZST900104*40蝉花菌丝体100mgJS10010110300mgJS30010330900mgJS900104*40

图1 人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响

2.3 对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响

结果如表3，图2所示，与空白对照组比较，各剂量的人工培养蝉花子实体或蝉花菌丝体对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期无明显的影响.

图2 人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响

表3 人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响

2.4 对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响

结果如表4 ，图3所示，与空白对照组比较，300 mg/kg人工培养蝉花子实体和900 mg/kg蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间有明显的延长作用.

组别剂量/kg组别代码n睡眠持续时间/lgminKB对照—KB101.161±0.188安神补脑液5mLYD101.335±0.095*蝉花子实体100mgZST100101.296±0.120300mgZST300101.494±0.216**900mgZST900101.207±0.246蝉花菌丝体100mgJS100101.188±0.462300mgJS300101.265±0.153900mgJS900101.431±0.191**

图3 人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响

3 讨 论

研究发现，人体通过充分睡眠可使疲劳神经细胞的生理功能恢复正常，精神和体力得到恢复[4].同时，睡眠过程中垂体前叶的生长激素分泌增高，对机体生长有显著的促进作用， 激素调节过程中核蛋白合成增加，有利于记忆力改善[5].睡眠不佳或不足会导致机体抵抗力下降，免疫系统紊乱，使患病机率明显增加[6-8].西药如安定等在改善睡眠的研究较为集中，虽然在一定程度上效果明显，但长期服用的依赖性与成瘾性很难克服.蝉花为虫生真菌，是一种传统的中药材，服用无依赖性.在宋代唐慎微所著的《经史证类备急本草》就有记载：“蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊，惊痫，夜啼，瘛疭，心悸”，从安全性及有效性两个角度对蝉花给予肯定.因此，对人工蝉花培养物的深入研究及科学开发改善睡眠的药品及保健品不仅是宏扬中医中药养生保健的重要课题，而且有一定的社会意义.

本实验结果表明，连续给予受试物30 d后，与空白对照组比较人工培养蝉花子实体300 mg/kg、900 mg/kg及菌丝体900 mg/kg对阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠一定的促进作用(P< 0.05)，且没有明显的剂量依赖关系；与空白对照组比较，300 mg/kg人工培养蝉花子实体和900 mg/kg蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间有明显的延长作用；但不同剂量的两种受试药物对巴比妥钠睡眠潜伏期基本无影响，且均无直接至眠作用.表明人工培养蝉花子实体和蝉花菌丝体对小鼠睡眠有一定的改善作用.

γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，也哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性氨基酸类神经递质，在睡眠调节中发挥重要作用[9-10].γ-氨基丁酸GABA通过增强 GABAA受体的功能从而延长戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间[11].本研究结果表明，与空白对照组比较，300 mg/kg人工培养蝉花子实体和900 mg/kg蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间有明显的延长作用，推测蝉花虫草系列产品可能是通过 GABAA受体的特殊结合位点(BZD 位点)与受体相结合[12-13]进而发挥到治疗作用.由此，可间接推测蝉花虫草的某些化学成分也可能通过对BZD 位点的作用，进而增强 GABA 与 GABAA受体的结合，发挥改善睡眠作用.因此，采用 ELISA法测定与BZD受体拮抗剂协同给药后小鼠头部 GABA 含量也是本实验进一步关注的重点.

5-HT 是机体调节睡眠及觉醒周期的重要神经递质，主要分布于松果体和下丘脑[14].5-HT 的合成过程中色氨酸羟化酶及5-HTP 脱羧酶起着重要的作用.当两种酶的活性受到抑制时，5-HT 在脑内的合成量减低，表现出失眠.药理学而言，睡眠作用与 5-HT 具有相关性主要体现在两个角度，戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期缩短、睡眠时间延长，本实验结果表明300 mg/kg人工培养蝉花子实体和900 mg/kg蝉花菌丝体对戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间有明显的延长作用，但不同剂量的两种受试药物对巴比妥钠睡眠潜伏期基本无影响，说明蝉花虫草人工培养物可能与 5-HTP 产生协同作用并使小鼠脑内 5-HT 含量变化从而延长了睡眠时间.另一方面，5-HT在动物体内与不同的受体结合可产生不同的作用.影响睡眠时间而不影响睡眠潜伏期的实验结果可能是蝉花虫草人工培养物同时激活和关闭了5-HT的不同受体而致.具体机制有待于深入研究.

本实验结果表明，与空白对照组比较，各给药组别均未发现有直接睡眠现象.在巴比妥钠阈下剂量催眠实验中与空白对照组比较人工培养蝉花子实体300 mg/kg和900 mg/kg及蝉花菌丝体900 mg/kg，小鼠入睡率呈显著性差异.300 mg/kg剂量组的作用效果与阳性对照组相当，表明人工培养蝉花子实体及蝉花菌丝体对注射阈下剂量巴比妥钠小鼠的入睡率的提高具有促进作用，且该作用在一定程度上呈正相关趋势；对小鼠睡眠潜伏期的影响实验，各给药组别低、中、高剂量与空白对照组比较小鼠睡眠潜伏期未见显著差异，说明蝉花人工培养物改善睡眠过程并不影响睡眠的潜伏期；对巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响，人工培养蝉花子实体300 mg/kg和及菌丝体900 mg/kg对巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间有显著延长作用，各与空白对照组比较均存在显著差异，且未见明显的剂量依赖关系.根据《保健食品检验与评价技术规范》对改善睡眠保健食品的判定标准可知，延长戊巴比妥钠睡眠时间、戊巴比妥钠阈下剂量催眠和巴比妥钠睡眠潜伏期三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有改善睡眠功能作用.本研究结果不仅为蝉花虫草培养物功能食品的研发提供科学依据，也将为蝉花虫草改善睡眠机制的进一步研究奠定基础.

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Experimental study of effect for synnema and mycelial of Isaria cicadae on sleeping

ZHANG Zhong-liang1,2, WANG Yu-qin1,2,FAN Mei-zhen1,2

(1.ZheJiang Bioasia Pharmaceutical Co.,Ltd , Jiaxing 314200, China; 2.Zhe Jiang Bioasia Life Science Research Institute , Jiaxing 314200, China)

To observe the effects of synnema and mycelial of Isaria cicadae improve the role of sleep in mice, Kunming mice were randomly divided into 8 groups, 10 for every group. Per day orally given different doses of synnema and mycelial of Isaria cicadae, after continuous administration of the test substance of 30 days, the experiments were performed, incliding direct effects of sleep test, extend pentobarbital sleep time experiment, direct sleep threshold dose of pentobarbital sodium pentobarbital sodium hypnotic sleep latency test and mice experimentally determined time, pentobarbital sodium-induced sleep time subthreshold dose of sleep and the incidence of sodium pentobarbital-induced sleep latency. Results indicated that compared with control group, the group synnema of Isaria cicadae (300 mg/kg; 900 mg/kg) and mycelial of Isaria cicadae (900 mg/kg) certain role for subthreshold dose of pentobarbital sodium-induced sleep in mice (P<0.05) and no clear dose-dependent manner. The control compared with control group, the group of synnema of Isaria cicadae (300 mg/kg; 900 mg/kg) and mycelial of Isaria cicadae (900 mg/kg) pentobarbital induced sleep time in mice significantly prolonged action. However, two different doses of the test drug sodium pentobarbital no effect on sleep latency, and there were no direct role to sleep. The synnema and mycelial of Isaria cicadae have some improvement on mice sleep.

Isaria cicadae; cordyceps; synnema; mycelial; sleeping

2015-06-25.

张忠亮 (1983-)，男 ，博士，研究方向：药物的新剂型与质量评价.

樊美珍 (1944-)，女 ，博士，博士生导师 ，研究方向：虫生真菌的产业化培育及健康食品研发.

R285

A

1672-0946(2016)06-0663-05