小麦类病斑突变基因 lm3的定位

杨佳秀，耿皆飞，李倩倩，刘录祥，谢彦周，王成社

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨陵 712100； 2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

小麦类病斑突变基因 lm3的定位

杨佳秀1，耿皆飞1，李倩倩1，刘录祥2，谢彦周1，王成社1

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨陵 712100； 2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

为进一步对类病斑突变基因lm3进行克隆和功能研究，以EMS诱变普通小麦花培品系H261所得后代中选育出的一个稳定遗传的小麦类病斑突变体LF2010为研究材料，通过BSA(bulked segregant analysis)、MBSA(multiple bulked segregant analysis)、小麦90K基因芯片结合BSA三种不同的基因定位策略对该突变基因进行定位。结果表明，lm3基因位于小麦6B染色体的长臂，与其两侧标记SWES2和Xbarc134的遗传距离分别为13.1 cM和3.8 cM，为一个新的小麦类病斑突变基因。

小麦；类病斑突变；基因定位；lm3

在小麦中，目前已报道的仅有7个类病斑突变体，分别为M66[11]、C591(M8)[12]、AIM9[13]、HLP[8]、Ning 7840[14]、Yanzhan 1/Zaosui 30分离群体中的一个稳定斑点后代[15]、LF2010[16]。不同类病斑突变体的表型存在不同程度的差异，并且不同类病斑表型对各自农艺性状、抗病性等的影响也各有不同，如突变体HLP与野生型相比产量性状差异不明显，对叶锈菌成株期抗病性显著增强[8]；突变体M66虽然产量较亲本明显下降，但对白粉病[11]、条锈病和叶锈病[9]的抗病性增强。迄今为止，小麦中仅有3个类病斑突变基因被定位，只有不断创造、发掘、定位更多的小麦类病斑基因，才能推动小麦类病斑突变机理、基因克隆等研究地进行。

通常情况下，基因定位是一个费时费力的过程，尤其是在小麦这种基因组复杂且庞大的植物中。为了尽快确定目标染色体，不同的基因定位策略随着生物技术的发展相继被尝试。BSA(bulked segregant analysis)法是快速定位目标基因的有效策略[17]。但试验中我们发现，当目标基因附近标记密度较低时，运用BSA法则可能会漏掉距离目标基因相对较远的分子标记，从而导致筛选到连锁标记的可能性大大降低，有时甚至会筛不到连锁的分子标记，导致定位失败。2012年，Hiebert等[18]提出了新的基因定位策略MBSA(multiple bulked segregant analysis)来提高BSA的灵敏度，Ghazvini等[19]对其做了具体地改进及验证。此外，随着基因芯片技术的出现，使得高通量SNP基因分型得以实现，进而为在小麦这样的复杂基因组中构建高分辨率的遗传连锁图谱提供了快速而有效的策略。2014年，Wang等[20]利用小麦90K芯片对8个不同作图群体进行了遗传变异分析，将46 977对SNP分子标记进行遗传定位，并利用其中的6个群体构建了包含40 267个遗传位点的整合图谱。这些标记数量可观的高密度遗传图谱为小麦基因组的研究提供强大的支持。在小麦中，9K、90K、660K芯片相继被开发，结合BSA，可以利用大量的SNP对一个较小的群体进行富集分析，为小麦基因定位研究开辟了一条全新、快速、高效的新策略。

LF2010是由EMS诱变普通小麦花培品系H261得到的一个稳定遗传的类病斑突变体，其斑点性状受1对隐性核基因控制，且表达受光照和温度的影响，推测LF2010为一类新的突变类型[16]。由于已定位的3个小麦类病斑突变基因分别为lm[14]、lm1[15]和lm2[15]，因此，这个类病斑突变基因暂时命名为lm3。本研究以突变体LF2010为研究材料，利用BSA、MBSA、小麦90K基因芯片结合BSA三种不同的基因定位策略，对突变基因lm3进行定位研究，以期为lm3基因的克隆和功能研究以及最终揭示小麦类病斑突变发生机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及其种植

LF2010是普通小麦花培品系H261经过EMS(ethane methyl sulfonate) 诱变所得后代中选育出的小麦类病斑突变体，经过连续5代自交已遗传稳定。2013年5月，将LF2010与普通六倍体小麦品种中国春杂交，随后分别播种亲本、F1、F2及F2∶3，从三叶期开始，以叶片是否出现黄色斑点为标准，鉴定植株的表型。

1.2 DNA的提取

一是构建事业平台。智库要有事情做，有研究的问题、项目、课题等，要有相关的科学有效的理论、方法、信息、手段等的支持，也要有专业、有水平团队支撑；

将LF2010与中国春杂交后自交得到的190个F2∶3代株系作为定位群体。按CTAB[21]法提取LF2010、中国春及定位群体各单株的全基因组DNA。

1.3 突变基因 lm3的初定位

1.3.1 BSA策略

参照Michelmore等[22]文章中所述BSA方法，随机选取F2∶3定位群体中8株绿色野生型单株的DNA等量混合构建正常性状池(BW)，8株斑点型单株的DNA等量混合构建突变性状池(BM)，然后将亲本LF2010和中国春间有差异的SSR分子标记在BW和BM之间进行筛选，在不同性状池间存在多态性的标记即为连锁标记。

1.3.2 MBSA策略

参照Ghazvini等[19]文章中所述MBSA方法，随机选取F2∶3定位群体中2株斑点型单株的DNA(含隐性纯合的目标基因)等量混合组建一个迷你池(mini bulk)，一共组建14个这样的mini bulk。将亲本间存在多态性的所有SSR标记在这14个mini bulk中进行筛选，在5个以上mini-bulk中与隐性亲本带型一致的标记即为连锁标记。

1.3.3 小麦90K芯片结合BSA策略

参照Michelmore等[22]文章中所述BSA方法，选取F2∶3定位群体中6株绿色野生型单株的DNA等量混合构建正常性状池(C-BW)，6株斑点型单株DNA等量混合构建突变性状池(C-BM)，送至北京康普森生物公司进行小麦90K芯片检测，2次样本重复。根据Wang等[20]提供的SNP位点信息确定基因池间的差异SNP在小麦各个染色体上的富集情况，最终根据这个SNP富集结果即可初步确定目标基因所在的染色体。

将90K芯片初步确定染色体上的多态性SNP对照Wang等[20]文章中小麦与二穗短柄草、水稻、高粱的对应关系表，可以得到SNP对应的二穗短柄草、水稻、高粱各自的基因区间，从而得到两基因池之间SNP的富集区。利用富集区SNP的序列设计基于小麦基因组序列的SSR引物并在基因池间检测其是否与目标基因连锁。

1.4 突变基因 lm3的精细定位

从F2∶3定位群体中随机挑选一定单株用于验证得到的连锁标记及检测初定位所得染色体上其他在亲本间有多态性的分子标记的多态性。将突变体LF2010特有的带型记作A，中国春特有的带型记作B，杂合带型记作H；若连锁标记为显性标记，则单株带型记作A/C或者B/D。利用JoinMap 4.0软件分析，并绘制相应的遗传连锁图。

2 结果与分析

2.1 遗传分析

类病斑突变体LF2010与中国春杂交，F1代单株全部为野生型的绿色表型，说明该基因为隐性基因；经卡方测验，F2群体中绿色表型单株与斑点表型单株的比例符合3∶1的分离比例，F2∶3群体符合1∶2∶1的分离比例，表明在这个群体中的目标性状受1对核基因控制。以上说明类病斑突变体LF2010的斑点性状在LF2010与中国春杂交的F2群体中为单基因隐性遗传(表1)。这与本实验室以前研究的结果相同。

2.2 突变基因lm3的BSA策略定位

杜丽芬[23]在京花一号与LF2010杂交的F2∶3定位群体中筛选到2对分子标记Xwmc388和cfa2187，本研究基于此，将这2对分子标记在亲本LF2010、中国春及其F2∶3群体单株构建的两基因池间进行筛选，结果显示，cfa2187在亲本间无差异，Xwmc388在亲本及基因池之间均存在多态性，初步表明Xwmc388与类病斑突变基因lm3连锁，但由于Xwmc388有多个位点，分别位于3A、4D、5A、6A、6B、7A染色体上，所以并不能根据分子标记Xwmc388初步判断目标基因lm3所在的染色体。

2.3 突变基因lm3的MBSA策略定位

选取Ghazvini等[19]列出的均匀分布在小麦21条染色体上带型单一的423对引物中标记Xwmc388所在的6条染色体上的110对SSR引物，及本实验室已有的位于这6条染色体上的27对SSR引物(表2)，进行亲本间多态性的筛选。在这137对引物中，68对在双亲间表现出多态性，作为进一步筛选的候选引物。将候选引物在14个mini-bulk间进行PCR扩增，经检测发现，分子标记Xbarc134 在14个池中均与隐性亲本LF2010带型一致(图1A)，Xwmc417在6个mini-bulk中与隐性亲本LF2010带型一致(图1B)，初步表明Xwmc417、Xbarc134与类病斑突变基因lm3连锁。Xwmc417有2个位点，分别位于6A、6B染色体上，Xbarc134仅有1个位点，位于小麦6B染色体上，因此可以初步确定突变基因lm3位于小麦6B染色体上。

2.4 突变基因lm3的小麦90K芯片结合BSA策略定位

根据整合的高密度90K SNP遗传连锁图谱[20]，可以得到基因池间差异SNP所在的染色体位置。从图2A中可以看出，6B染色体上多态性SNP数目最多，为95个，占已知位置的总SNP数目的36.7%，与图2B结果基本一致，说明控制斑点的基因最可能在6B染色体上，但仍需进一步地验证分析。

表1 突变体LF2010与中国春杂交后代性状分离比

Table 1 Segregation for spotted mutation

群体Population总株(家系)数Totalnumberofplants(lines)绿色株(家系)数Numberofgreenplants(lines)分离家系数Numberofsegregationlines斑点株(家系)数Numberofspottedplants(lines)分离比Segregationratioχ2P值PvalueF11111F2190139513∶10．0250．84F2∶31804393441∶2∶10．2110．90

M：DL2000；P1：LF2010；P2：中国春；1～14：分别由2个突变型单株所构建的14个迷你池。

M：DL2000; P1：LF2010; P2：Chinese Spring; 1～14:Fourteen mini bulks consisting of two mutant plants,respectively.

图1 SSR分子标记Xbarc134(A)和Xwmc417(B)的电泳结果

Fig.1 Electrophoresis of fragments amplified with SSR markers Xbarc134 (A) and Xwmc417 (B)

A和B为2个重复。 A and B indicate two replicates.

综合2次重复结果，得到多态性SNP在6B染色体上的富集区，对照Wang等[20]文中各物种之间的线性关系，得到6B染色体上SNP富集区对应的二穗短柄草、水稻、高粱各自的基因区间(表3)。利用所得区间内的二穗短柄草的基因对应的SNP序列信息设计了69对基于小麦基因组的SSR引物(表2)，其中37对在亲本间有多态性。由于染色体已经初步确定，试验重心已由确定目标基因所在染色体转为得到与目标基因紧密连锁的分子标记，因此利用BSA法对37对亲本间有差异的引物进行筛选，结果得到6BLm15、6BLm22、6BLm59在池之间存在差异，初步表明这3对引物与lm3连锁，同时验证了芯片混池快速确定染色体的结果，基本确定了突变基因lm3位于6B染色体上。

2.5 连锁标记的验证及连锁图的构建

随机选取F2∶3定位群体中110个单株进一步验证引物Xwmc388、Xwmc417、Xbarc134、6BLm15、6BLm22、6BLm59是否与类病斑突变基因lm3连锁。数据分析结果表明，该突变基因位于SSR标记Xbarc134和6BLm22之间。由于Xbarc134和6BLm22均位于6BL染色体上，因此搜索6BL上的SSR及EST-SSR引物，将得到的6BL染色体上亲本间有差异且带型清晰的引物均在F2∶3群体中进行分析，最终得到如图3的遗传连锁图谱。该图谱包括了11对SSR引物、1对EST-SSR引物、3对基于芯片数据开发的SSR引物，其中距离目标基因最近的两侧引物为SWES2和Xbarc134，其遗传距离分别为13.1 cM 和3.8 cM。

表2 本实验室已有的SSR引物(No.1-No.27)及本研究基于SNP序列重新合成的SSR引物(No.28-No.96)

Table 2 SSR primers kept in our laboratory(No.1-No.27) and resynthesized based on SNP sequences in this study(No.28-No.96)

编号No．SSR引物名称NameofSSRprimer正向引物序列(5′⁃3′)Forwardprimersequence(5′⁃3′)反向引物序列(5′⁃3′)Reverseprimersequence(5′⁃3′)1barc310GGGCGGCGCATGTGCACCTAGCGTGGAAGCGACTAAATCAACT2barc356CGCTAGAGCTGTTTGAGGGGAGGAGCGCATGTAGGGGGAGGCTTCTTTT3gwm480TGCTGCTACTTGTACAGAGGACCCGAATTGTCCGCCATAG4cfa2234AATCTGACCGAACAAAATCACATCGGAGAGTATTAGAACAGTGCC5gwm155CAATCATTTCCCCCTCCCAATCATTGGAAATCCATATGCC6wmc388TGTGCGGAATGATTCAATCTGTGGCCATTAGACTGCAATGGTTT7wmc331CCTGTTGCATACTTGACCTTTTTGGAGTTCAATCTTTCATCACCA8barc334ATCCGCGTGTCAAACTTCTTCCGGGCTGGCTGGGCTAAATG9cfd54TCGTTCCAAAATGCATGAAAAAGGGCCAGAAATCTGTGTG10gwm205CGACCCGGTTCACTTCAGAGTCGCCGTTGTATAGTGCC11barc117TCATGCGTGCTAAGTGCTAAGAGGGCAGGAAAAAGTGACT12barc141GGCCCATGGATAATTTTTGAAATGCAATTCGGCCAAAGAAGAAGTCA13barc330GCACTAAGCGCTCTTTATTTACCCTGCATCTGGTATGGAGA14barc319GCAGAGCTACGGCAATGTGCGTAAGTCCCGGAAGTAACAGAA15barc171GCGGGGTCATCTTAGTAACTCAAATAACTGTCAACGTTGGTTCACATTCA16barc113GCGCACAACAACGGACACTTAACAATTGGGACTCATTTAGCTTCTACTCGCCATTA17gwm169ACCACTGCAGAGAACACATACGGTGCTCTGCTCTAAGTGTGGG18gwm617GATCTTGGCGCTGAGAGAGACTCCGATGGATTACTCGCAC19barc79GCGTTGGAAAGGAGGTAATGTTAGATAGTCGTGGGTTACAAGTTTGGGAGGTCA20barc24CGCCTCTTATGGACCAGCCTATGCGGTGAGCCATCGGGTTACAAAG21barc178GCGTATTAGCAAAACAGAAGTGAGGCGACTAGTACGAACACCACAAAA22barc134CCGTGCTGCAAATGAACACAGTTGCCGGTTCCCATTGTCA23wmc168AACACAAAAGATCCAACGACACCAGTATAGAAGGATTTTGAGAG24gwm60TGTCCTACACGGACCACGTGCATTGACAGATGCACACG25cfa2110TCACTACCCGCATGAACAAATTCTGCACAAACCGTTCTGA26cfa2123CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACCACCGGCCATCTATGATGAAG27gwm332AGCCAGCAAGTCACCAAAACAGTGCTGGAAAGAGTAGTGAAGC286BLm01TTTCTAACCCATTCGTGACTAGAATAGGGGTTATCTTCCAGA296BLm02GGAAGAAGGGAGGAAATAAATGCGTCATTTCATTGAATTTT306BLm03TTGGACAACAAGTAGAGCAGTTCGCTAGTGACATACAGTGAA316BLm04GGAAAATTCAATGAAATGACGGAGAATTATACTCCCCAAACG326BLm05TCCCAAATGATGCATATAGACCTTTCAGGAGCAATTAGTCAA336BLm06TGATGGAGCAGTCAATATTTCGTAGATCCTGATCCCAAAGAC346BLm07CCAAATGTTCATCTTGTTTGTTGGTTGGTGATCAGAACTTAC356BLm08TTGCTTATTTGCTTACCTCACACTTCGACTGTACAACACCAT366BLm09GGTTTCATAGGCCTGTTCTCCATCACATGAAACAGATCACA376BLm10CAGATCATGTCTCCAAGGTCATCAGAAACAAGTGCTAATCG386BLm11AGGTTTGGACATGTGGATAATTTTACCTTTTATATGCCATCG396BLm12CTAAAAATTGACTGCACCATTTTTGTTTGGTAGTCTGTTCGT

(续表3 Continued table 3)

编号No．SSR引物名称NameofSSRprimer正向引物序列(5′⁃3′)Forwardprimersequence(5′⁃3′)反向引物序列(5′⁃3′)Reverseprimersequence(5′⁃3′)406BLm13ATACTCGAAACCTTCTGAACCGTGAAATTTCGATCCCAAAG416BLm14CAAAGTCTGCTAGCTTTAGGAAGCAGCTATAGGCGTTCTAGT426BLm15GCACAGCCTTTAATCATCTACACACGAAGCTCTCTATCAATG436BLm16ACGTATGCCATCAGTAACCTACACCAAGCGTAAAGTGAATAA446BLm17GAGATCTTATGGGTTTCACCTCAGTTTCCAGAAGGAACATAA456BLm18CGCAAGTTGTATGTTGACTTCCCATCAGATAACACCAATAGC466BLm19TACTCCCTAATCTGCAGTAGCCATGTATGTAGCAGCAGAACA476BLm20TCATTGTACTGCGATGTTGTAGGTGGATGAAGCTAGGTAGAG486BLm21ATCGACATCAACTCGATCCTTTGTGGTTGCTAAAAGTGAC496BLm22ACCTTCATCTTGGACTTCTTGGTAGCGGTTGAGAGAAAGAG506BLm23AGAGCTTTGTCTTCACCTTCTTGAATTTCGATCTGAACAAAC516BLm24AAAAAGGTTCACATTGTTTCCAACTAATCAATGCATCCTCAA526BLm25TCTCTTCTTTTTAGGGCTTTCCAGTAGAAATCGAACTGAGGA536BLm26AAATGCCATGGTTAAACTACAGTAGGCTGAATGATGCTACC546BLm27ACCACCAAAAGATTTAGAAGCGCACCGCTAAGCAACACTA556BLm28AATGTTTTAACTCAGGCACAACCCAAGACATCAAAGTGTATC566BLm29GAATCGTGTGTTGATTTGGTCAGAAACAAGGAACGGTTAAT576BLm30CTGCTTATTGGAAATTGTTTCTTTAACCGATCTTCTGTTTTCA586BLm31ACACTCTTACATTGCTTTCCATATTCTGGTGGCAGATTTGTA596BLm32AGGTGTGACATGGAAACAAGTTATTAGTGGCCTCTCTCTCC606BLm33ACAGAGGGAGTAGTGAGTGGTCATTGATGTGTGTGTGTTCAT616BLm34ATGGAGTTGTACGAGCAATAACTTTGCAACTATGCTAATCGT626BLm35TCTGAATCACCCAGAAATAAATGATTAAGGCGTCTCCTCT636BLm36TTGTGAAAGGACAGAGTTCATTCCAGGTAAGATAACCAATCA646BLm37TCGAGATGAGTTTGAGCAGTGAGACGTACAGGTGATTAGA656BLm38GTGTCGAGGTCTTGGATGTAAGATAGAGCAGGTTTTCACC666BLm39GCTCAACATCATTTGAAAAACTGTTAAAAGTGGTGTCCAAAG676BLm40GACGTAGGCTGTTGGATCTCTAATTAATCGCAGCTGTACG686BLm41CTGGAACAGGAGGCAAAGCAGTGTAAATAACGTCGCTTC696BLm42TCTAGATCAAACTCCGAAACCGTTTTGCTTGAGCAGACG706BLm43AGAAGAAGAGAAGGACGTGACGTCGTTGTCTCCAGTGTAAAT716BLm44GTCAGAGGGCTAGTGGTAAATTTGTGCTGATAGTGTCAAAAA726BLm45TCAGCTAAAAGTGATGGCTACCATTTCGATTCCCAATCTT736BLm46GTTCAATGTATTGTTCCTTGGAACGATGACCCTTTCACTATT746BLm47ATAATTTCTATGCGGAAGAGCTCCCTAAATCCTGAAAGAAAC756BLm48TTCTTTCAGGATTTAGGGAAGGGATATTTTCCTTTTTCATCG766BLm49CAGACGATGATGACTTTATGCTCTGTTCTGATCTCTTTTGCT776BLm50CAAGCTGAAAACAGATCAAAGAGCTTGCACTACCCTAGAATC786BLm51CATGATACGCTACAATGTTGACCTCCCATCTCCATATTATTT796BLm52CGGTAAAATATTCTTCAGCAATGATAGATATCAATGGGGATG806BLm53CTGTTTTTAATGCCTCTTTTGCTGGTCCATATTAAAGCAGTG816BLm54TATATAGTGCGATGGTTTTGGGATAAAAACATCCATGTCACG826BLm55GCGATGTCAATGAAACACTACGGCTACTTGGTTGGAAACTAC836BLm56AGGGTAAACCAATTAAGAAGCACTTCACTGAGGAGGAGGAG846BLm57TGCATCTTAGCTAATTGTGGTGTCAATCGAATCCATAGAGGT856BLm58CCACCATTGCTTGTTAGTTTAGCTGCTACTGCTGCTATTATC866BLm59TTGATAGAGGCGTAGAAATGAGGCTTCTTATTTGAGATGGTT876BLm60AAGATAGATAACGTTCGTTGCGAGAGTGATGGAGTCAAGGTC886BLm61TAATTTTCATCGGTCATTCTGAGTAGTGGAGGAGTGATGGAT896BLm62ATCCATCACTCCTCCACTACTGGGAATGGGAGTTAGTACATT906BLm63ATTGCCCTTTCATACTTTTTCTGGTAGGGTACGTACATTTTG916BLm64TGAGAAGCAGAACCCAGTATACAATCATCCTCCCCTAGATA926BLm65TTTTACATGGAGAAACCACACAGTGAACAAGAAATCCATGTG936BLm66CACATGGATTTCTTGTTCACTGTTGTAGTGGTTGTGGTTTGT946BLm67GATGAAGACGATGAAGATGAGGTGCTACAACAGACATTAGGG956BLm68ATAAAAACAGTAGCGGTGGTTAATGTCTCACAGAAAATCGAA966BLm69TATAATACGCAGGCAACAGACATCCTTCCTCTGCTTGTTAAT

表3 小麦、水稻、二穗短柄草和高粱的共线性关系

Table 3 Macro-colinearity relationship among wheat,rice,Brachypodiumdistachyonand sorghum

90KSNP标记90KSNPmarker二穗短柄草基因Brachypodiumdis⁃tachyongene水稻基因Ricegene高粱基因Sorghumgenewsnp＿CAP11＿c3599＿1741800Bradi3g50010．1LOC＿Os02g42890．1Sb04g033650．1＿PACid＿1968195Ex＿c20946＿574Bradi3g51617．1wsnp＿Ku＿c5744＿10166561Bradi3g51910．1LOC＿Os02g45920．1Sb04g031640．1＿PACid＿1967964RAC875＿c4420＿371Bradi3g51940．1LOC＿Os02g45950．1Sb04g031610．1＿PACid＿1967960Ra＿c23874＿338Bradi3g52367．2LOC＿Os02g46990．1Sb04g030980．1＿PACid＿1967873wsnp＿Ra＿c7889＿13482164Bradi3g55120．1Tdurum＿contig7986＿704Bradi3g55950．1Jagger＿c1231＿85Bradi3g55960．1LOC＿Os02g57830．2Sb04g037890．1＿PACid＿1968698RAC875＿c45987＿132Bradi3g56110．1LOC＿Os02g57990．1Sb04g037940．1＿PACid＿1968703CAP8＿c7260＿77Bradi3g56460．1LOC＿Os02g49320．1Excalibur＿c28014＿99Bradi3g56460．1LOC＿Os02g49320．1Sb04g029450．1＿PACid＿1967686Tdurum＿contig12648＿732Bradi3g60430．1LOC＿Os02g58230．1Sb04g038220．1＿PACid＿1968733RAC875＿c86296＿99Bradi3g60430．1LOC＿Os02g58230．1Sb04g038220．1＿PACid＿1968733BobWhite＿c447＿897Bradi3g60446．1RAC875＿c28848＿330Bradi3g60477．1LOC＿Os02g58280．1Sb04g038270．1＿PACid＿1968738

图3 突变基因 lm3在小麦6BL染色体上的遗传连锁图

3 讨 论

在小麦中，已定位的类病斑突变基因有3个，Li和Bai[14]报道的小麦品系Ning 7840为自然突变产生的类病斑材料，利用Ning 7840/Chokwang的重组自交系将控制Ning 7840黄色斑点性状的隐性基因lm定位在小麦1BL染色体上；Yao等[15]在Yanzhan 1/Zaosui 30的分离群体中发现了受光照诱导的类病斑突变性状，其实是两个隐性基因互作产生的斑点症状，对控制斑点性状的这两个互作基因进行定位，其中来自亲本Zaosui 30的lm1被定位于小麦3BS染色体上Xwmc674与Xbarc133/Xbarc147之间，遗传距离分别为1.2 cM、3.8 cM，另一个来自亲本Yanzhan 1的lm2被定位到小麦4B染色体的长臂，距离两侧标记Xgwm513、Xksum154的遗传距离分别为1.5 cM、3.0 cM。本研究的类病斑突变体LF2010的突变基因虽然其表达也受光照诱导[16]，但被定位于小麦6BL染色体上，不同于之前定位的任何一个类病斑基因。因此，为一个新的类病斑突变基因，将其命名为lm3。

在基因定位中，为了找到目标染色体区段，人们提出了多种策略，其中应用最广泛的是Michelmore等[24]于1991年提出的BSA法，该方法简单方便，能够快速检测到目标基因相关的区域。但由于小麦SSR遗传图谱标记密度不足够高，有些染色体区段还存在较大的gap(>30 cM)，因此该方法在结合传统SSR分子标记时也存在一定的弊端，就是灵敏度不高。例如，小麦杆锈基因SrCad的定位，一开始采用BSA法定位时失败，最终由全基因组定位(whole genome mapping，WGM)法定位成功[25]。但全基因组定位需要消耗大量的人力物力，由此Hiebert等[18]提出了MBSA法，同时兼备了全基因组定位的灵敏度与BSA法的操作高效性。Hiebert等[26]运用MBSA法将小麦叶锈抗性基因 Lr70成功定位在小麦5D染色体短臂。突变基因lm3的定位工作，一开始单纯依靠BSA法进行基因定位时，656对SSR引物在京花一号与L2010的F2∶3定位群体中只筛选到两个连锁的分子标记Xwmc388和cfa2187[23]，而在中国春与LF2010的F2∶3定位群体中cfa2187在双亲间没有多态性，Xwmc388在染色体上有多个位点，由于本实验室没有缺体材料，所以并不能确定目标带型是位于哪一条染色体上。基于此，我们初步将目标染色体锁定在Xwmc388所在的染色体，运用MBSA提高检测的灵敏度进行连锁标记的筛选，得到两个连锁标记，最终确定突变基因的目标染色体。说明MBSA在小麦这样基因组庞大、遗传连锁图密度不够高的作物中进行基因定位是切实可行的。

随着生物芯片的不断发展，新的快速定位基因的策略应运而生。相对于传统的利用全基因组SSR标记筛选目标染色体区段的方法，更加省时省力、快速精确。同时，90K芯片是通过不同小麦品系的转录组数据开发而来，检测到的SNP大多数位于编码区，可以提高定位精度和准确性。本研究即是利用90K芯片与BSA的结合，对两个相对性状基因池进行SNP检测，根据SNP的富集结果快速地发现了多态性SNP较多的的集中在6B染色体上，经6B富集区设计引物的筛选及F2∶3群体的验证分析确定突变基因lm3在6B染色体上，与MBSA结果一致。说明利用90K SNP芯片快速进行小麦基因定位的策略是切实可行、简单高效。需要说明的是，本研究中90K芯片在池之间的检测结果在6B以外的个别染色体上SNPs的数量也相对较多，并且得到的SNP富集区间也相对较大，推测是由于建池时所选取的F2∶3单株数目较少，使得池之间除目标区域外其他背景值干扰性太强。可以在确保F2单株正确的基础上选取较多的单株进行混池检测，所得的富集区间会大大缩小，更加富有针对性，有利于开发标记加密目标基因。后续将选用lm3两侧的共显性标记对更大的F2∶3群体进行筛选，得到足够数量的重组单株作为筛选加密标记的群体，并选取更多数量的单株混池进行基因芯片(90K或660K)的检测，根据富集区的信息开发标记对类病斑突变基因lm3进一步加密。

4 结 论

小麦类病斑突变体LF2010的黄色斑点性状为单基因隐性遗传。通过运用BSA、MBSA、小麦90K芯片3种不同的基因定位策略将小麦类病斑突变基因lm3定位于小麦6B染色体的长臂，距两侧标记SWES2、Xbarc134的遗传距离分别为13.1 cM和3.8 cM，为一个新的小麦类病斑突变基因。

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Mapping of Lesion Mimic Mutant Genelm3 in Common Wheat

YANG Jiaxiu1,GENG Jiefei1,LI Qianqian1,LIU Luxiang2,XIE Yanzhou1,WANG Chengshe1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

In order to clone the lesion mimic mutant genelm3 and analyse its function further,a lesion mimic wheat mutant LF2010,obtained from an anther culture line H261 which was mutated with EMS,was chosen as material,and three kinds of different gene mapping strategies were taken to map it,including BSA(bulked segregant analysis),MBSA(multiple bulked segregant analysis),and wheat 90K gene chip combined with BSA.The result showed that a genetic linkage map containing 15 pairs markers linked withlm3 was obtained. Finally,lm3 was mapped on 6BL of wheat chromosome,13.8 cM away from marker SWES2 and 3.8 cM away from Xbarc134.lm3 is a new gene of wheat lesion mimic mutant.

Wheat; Lesion mimic mutant; Gene localization;lm3

时间：2016-12-07

2016-05-26

2016-11-13

国家重点研发计划项目(2016YFD0102101)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2014YB081)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2014KTZB02-01-01，2015KTZDNY01-01-02)；西北农林科技大学南阳小麦试验示范站建设项目；西北农林科技大学唐仲英育种基金项目

E-mail:jiaxiu_0906@126.com(杨佳秀)；18700895579@163.com(耿皆飞，与第一作者同等贡献)

谢彦周(E-mail:xieyanzhou@gmail.com); 王成社(E-mail:wangcs2008@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)12-1578-09

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1748.006.html